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三色堇(Viola×wittrockiana Gams.),堇菜科(Violaceae)堇菜属(Viola)花卉,是北方常见的一二年重要的冬春观赏花卉。三色堇花的直径约两到三英寸,花瓣由内部平开的三个花瓣和外围两个略微重叠的花瓣组成。三色堇的花色众多,主要分红色系、黄色系、和蓝色系。带色斑或条纹的三色堇品种花斑面积大、稳定、观赏价值高,因其独特的造型被称为“猫脸花”,且相关研究表明,三色堇是研究植物色斑形成的理想材料。为了更为清楚地了解三色堇花斑形成的分子机理,我们以大花三色堇’梦蝶’(黄底黑斑)品种为材料,利用denovo转录组测序Illumina HiSeq 2000对其进行转录组测序,总结了其中与花色相关的基因,推测了可能的花色合成途径,并对其中花色素苷合成相关的基因在不同花色三色堇中的表达进行了对比分析,同时对花斑形成关键基因的启动子进行了初步克隆,优化了克隆启动子所用的FPNI-PCR体系。具体结果如下:(1)转录组测序:共获得118747的transcripts(转录本),大约有43908个unigenes从转录本中进一步获得并比对6个数据库加以注释。总共有18979 unigenes得到GO注释;根据转录组在KOG数据库中的对比结果,有8507 unigenes被归为25个功能分类;7680 unigenes 比对 KAAS(KEGG Automatic Annotation Server)进行 BLAST分析注释后,被归为242个标准参考途径。同时,对转录本获得的43908个unigenes进行了两个类型的分子标记,总共获得194781SNPs和4164SSRs,此外,在SSR标记中,总共有11931对引物被设计出来,并进行了随机验证。(2)花色相关基因的挖掘:对所获得转录组的数据进行进一步研究,从中挖掘出与花色相关的基因,主要包括类黄酮花青素代谢、类胡萝卜素代谢及甜菜色苷色素相关代谢。有99个与色素代谢相关的unigenes被发掘出来,同时,根据KEGG注释结果,我们推测得到了三色堇中类黄酮花青素代谢和类胡萝卜素代谢可能的途径。特别值得注意的是,我们还从三色堇的转录组中获得了可以将DOPA转化为甜菜醛酸进一步获得甜菜色苷的 4,5-DOPA dioxygenase extradiol(ID,comp54934_c0),但是在转录组数据中未检测到DOPA形成必须的酪氨酸酶,证明了 DOPA的缺乏是三色堇中不能合成甜菜素的原因,支持DOPA的缺失是植物中甜菜素与花青素不能共存的可能原因的假设。(3)各结构基因在不同花色中的差异性表达分析:利用转录组中获得的花色素苷合成代谢途径中所有结构基因及其同源基因序列设计半定量引物,对7个花色品种的三色堇色斑区及非色斑区的结构基因的表达进行比较。结合前人研究推测:在三色堇中DFR基因可能是白花形成的重要原因,且DFR同源异型基因的表达可能对三色堇花色素的表达产生影响;F3’5’H基因、F3’H基因可能对三色堇飞燕草素(Delphinidin)的产生起到重要作用,同时猜测,这两个基因对三色堇色斑(或条纹)的产生具有重要影响。(4)关键基因gDNA克隆及FPNI-PCR体系优化:克隆并获得基因ANS和DFR的gDNA,并进行生物信息学分析;对FPNI-PCR反应体系进行了优化,实验表明:FPNI-PCR第一轮反应体系应以稀释后DNA为模板,20μL体系中,用量在4.5ng～10ng。第三轮最优反应体系为:20 μL反应体系中,特异性引物浓度0.2 μmol.L-1,引物SP2浓度0.75 μmol.L-1,Taq DNA 酶用量 1.0 U,dNTP 用量 2 μL,10 × Buffer(20 mmol.L-1、Mg2+plus)用量2 μL,模板1 μL(第二轮反应稀释100倍后取1 μL为模板),dd H2O补足。第三轮反应中,退火温度显示64℃、66℃时条带最为清晰。