脾虚是多种胃肠疾病的主要中医证型之一;胃肠疾病脾虚型患者可见胃肠黏膜损伤的病理改变,临床和实验研究表明健脾益气方药对胃肠黏膜损伤有修复作用。胃肠黏膜与外界相通,黏膜结构易受损伤破坏,而胃肠黏膜的修复更新对于维持胃肠道稳态有重要作用。胃肠黏膜损伤后修复的形式包括早期整复阶段和后续修复阶段。早期整复阶段以上皮细胞的迁移为主,后续修复包括细胞迁移、增殖、分化、黏膜重建等过程。多胺在胃肠黏膜损伤后修复过程发挥重要作用。在小肠上皮细胞迁移多胺信号通路中,多胺调节细胞质游离Ca2+浓度([Ca2+]cyt)以影响细胞迁移;钙通道蛋白TRPC1是位于细胞膜上的非电压依赖性的阳离子通道蛋白,主要参与细胞内Ca2+稳态的调节;小窝蛋白（Cav1）是钙通道的调节蛋白;TRPC1和Cav1主要通过储存操纵性钙通道(stored-operated Ca2+channels,SOC)调节[Ca2+]cyt。磷脂酶Cγ-1（PLCγ-1）是膜相关磷脂酶的一种,参与调节胞内钙库Ca2+释放;[Ca2+]cyt可促使GTP结合蛋白Rho A、Rac1活化,影响细胞骨架重构从而促进细胞迁移;钙调节蛋白相互作用形成的蛋白复合体如TRPC1/Rho A、TRPC1/Cav1、PLCγ-1/Rac1等对调控细胞迁移过程起重要作用。课题组前期的动物和细胞实验研究表明,健脾益气方药（黄芪、白术、甘草、人参、四君子汤等）对胃肠黏膜损伤修复作用,与其影响多胺及其调控机制有关;但健脾益气中药胃肠黏膜保护作用的精确调控机制有待进一步研究。研究目的课题组前期研究发现黄芪多糖促进小肠上皮细胞（IEC-6）迁移的作用与其影响多胺信号通路有关,其中对Ca2+的调控是关键指标。本研究在此基础上,进一步观察黄芪多糖对IEC-6细胞迁移多胺信号通路Ca2+调节蛋白复合体等的影响,以探讨益气健脾中药黄芪促进胃肠黏膜损伤修复的作用机制。研究方法1.黄芪粗多糖（黄芪多糖1）制备200g黄芪药材打粉,12倍体积纯水浸泡2h,煎煮2h,纱布过滤,再煎煮2h,收集2次水提液。黄芪水提液离心（离心机条件设定12000rpm,20min）。上清液浓缩至原始体积的1/5。将5倍体积95%乙醇加到浓缩液,乙醇混合物4℃冰箱过夜,沉淀物真空抽滤。将醇沉所得沉淀物继续醇沉,以上步骤重复3次。最终提取物冷冻干燥。2.黄芪去蛋白多糖（黄芪多糖2）的制备Sevag试剂为氯仿:正丁醇5:1。将粗制黄芪多糖溶于约400m L超纯水,加入体积比1/5的sevag试剂,避光通风下充分摇晃15min,静止3h;待液体完全分层,除去下层乳白色蛋白层。取水层,重复上述步骤5次,直到无乳白色蛋白层出现,终止反应。收集水层冷冻干燥。3.黄芪纯化多糖（黄芪多糖3）的制备称取2g“黄芪多糖2”加50m L纯水溶解,分次加入纤维素柱,加样完毕后,让溶液流入柱底层后关闭引流开关,溶液过夜,充分吸附。次日用600m L纯水进行洗脱,自动接样器进行接样,流速1.5m L/min顺序接样。苯酚-硫酸法测定洗脱液中所含多糖含量,合并吸光度值,样品冷冻干燥。4.苯酚-硫酸法测定“黄芪多糖3”糖含量（以葡萄糖计）苯酚-硫酸法测定黄芪多糖3的糖含量。紫外分光光度计检测,波长490nm,浓度为横坐标（X）,吸光度值为纵坐标（Y）,绘制葡萄糖浓度-吸光度标准曲线。样品含量测定:精密量取黄芪多糖3样品溶液2m L于容量瓶,平行3份,分别按照空白管的方法操作。黄芪多糖3所收集洗脱液各样品分别取200μL,各管加纯水至2m L,按处理葡萄糖标准品的步骤进行。5.高效液相色谱仪检测“黄芪多糖3”图谱色谱条件:色谱柱:Ultrahydrogel TM Liner（7.8×300mm）水溶性凝胶柱;流动相:超纯水;流速:0.8m L/min;柱温:30℃;进样量10μL。标准曲线的制作:取上述葡聚糖对照品溶液,分别进样,记录出峰时间,以色谱峰的保留时间（Rt）为横坐标,对照品分子量的对数值（Ig M）为纵坐标,进行回归分析。分子量的测定:取黄芪多糖3配制成1.5mg/m L溶液。按照色谱条件进行分析,记录保留时间,通过标准曲线制作的回归方程可得黄芪多糖3的相对分子量。6.细胞迁移实验以“黄芪多糖3”为受试药,以下简称黄芪多糖。细胞以4×10~5个/m L密度接种于六孔板,每孔2.5m L;培养箱培养;细胞长满后,用200μL移液器吸头沿6孔板中央垂直45度方向划痕;PBS冲洗;加入2.5m L含2%血清的DEME培养基。筛选黄芪多糖促进细胞迁移有效浓度范围分组如下:正常组,黄芪多糖组（20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L）。DFMO负荷实验分组:正常组,DFMO模型组（2.5mmol/L）,DFMO+黄芪多糖组（40mg/L、80mg/L）,DFMO+SPD（5μmol/L）;si-Cav1负荷实验分组:正常组,si-Cav1模型组,si-Cav1+黄芪多糖组（40mg/L、80 mg/L）,si-Cav1+SPD（5μmol/L）。Rac1抑制剂NSC23766负荷实验分组:正常组,NSC23766模型组,NSC23766+黄芪多糖组（40mg/L、80 mg/L）,NSC23766+SPD组（5μmol/L）。Rho A抑制剂Rhosin负荷实验分组:正常组,Rhosin模型组,Rhosin+黄芪多糖组（40mg/L、80mg/L）,Rhosin+SPD组（5μmol/L）。每组于0h和12h观察拍照。每孔采集5个视野,软件Imag J进行划痕前后面积计算。相对迁移面积率=[（0h面积-12h面积）/0h平均面积]?100%。7.Western Blot法检测Rho A、Rac1、Cav1、TRPC1、PLC-γ1蛋白表达黄芪多糖对细胞迁移多胺-钙离子信号通路影响实验分组:正常组,黄芪多糖组（40mg/L、80mg/L）,SPD组（5μmol/L）;DFMO负荷实验分组:正常组,DFMO模型组（2.5mmol/L）,DFMO+黄芪多糖组（40mg/L、80mg/L）,DFMO+SPD组（5μmol/L）。各组细胞裂解液与SDS混合,煮沸变性5min。蛋白混合液加入10%SDS-PAGE电泳;电泳结束后将蛋白凝胶电转至PVDF膜。含5%脱脂奶粉的TBST封闭条带。用含TRPC1、PLCγ-1、Cav1、Rac1、Rho A抗体的TBST4℃过夜孵育。二抗室温条件下与条带孵育1h。免疫复合物在ECL chemiluminescence substrate反应5min,化学发光成像仪显示蛋白条带。8.免疫沉淀法检测TRPC1/Rho A、TRPC1/Cav1、PLCγ-1/Rac1复合体表达黄芪多糖对细胞迁移多胺-钙离子信号通路复合蛋白影响实验分组:正常组,黄芪多糖组（40mg/L、80mg/L）,SPD组（5μmol/L）;DFMO负荷实验分组:正常组,DFMO模型组（2.5mmol/L）DFMO+黄芪多糖组（40mg/L、80mg/L）,DFMO+SPD组（5μmol/L）。各组细胞裂解后离心取上清。取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg TRPC1抗体（PLCγ-1抗体或种属相同的Ig G）加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜。取10μL protein A+G琼脂糖珠加入到与抗体孵育过夜的细胞裂解液,4℃缓慢摇晃孵育2h?4h,使抗体与protein A+G琼脂糖珠藕连。免疫沉淀反应后,3000 rpm离心3min,小心吸去上清,琼脂糖珠用1m L裂解缓冲液洗3?4次。加入15μL的2×SDS上样缓冲液,沸水煮5min。后续进行Western blotting检测及分析。9.激光共聚焦显微镜检测细胞Ca2+水平用Fluo4AM检测Ca2+。处理后的细胞在培养箱培养12h后,加入1μL Fluo4AM在莱卡激光共聚焦显微镜下检测,激发波长494nm,发射波长516nm。将参数调节一致,拍照记录Ca2+荧光图片,各组拍照5张。使用Image J分析记录荧光值。10.小RNA干扰Cav-1实验（si-Cav1）将si-Cav1与Lipofectamine 2000按照100pmol（25）5μL比例混合,室温孵育20min,加入含2.5m L的Opti-MEM培养基（Invitrogen）的六孔板中培养。培养48h后收获细胞进行后续实验。实验结果1.黄芪多糖各样品检测结果:黄芪多糖1、2、3得率分别为:5.82%、3.38%、1.25%,糖含量分别为32.20%、52.40%、74.97%;其中“黄芪多糖3”糖含量最高并进行后续检测。高效液相色谱图结果显示“黄芪多糖3”为杂多糖,最大峰占比62.49%,相对分子量6130Da;“黄芪多糖3”水解后测得各单糖比例为:葡萄糖47.13%、阿拉伯糖33.40%、甘露糖9.95%、核糖7%、半乳糖2.88%;对“黄芪多糖3”进行红外色谱图检测,结果提示在不同时间段有不同的吸收峰。2.黄芪多糖对细胞迁移作用的剂量筛选:选择“黄芪多糖3”（以下简称“黄芪多糖”）为细胞实验的受试药,设20、40、80、160mg/L四个剂量组;结果显示黄芪多糖各剂量组均有促进细胞迁移的作用（细胞迁移率黄芪多糖20mg/L与空白组比较P<0.05,黄芪多糖40、80、160mg/L组与空白组比较均P<0.01）,其有效剂量20mg/L?160mg/L;以40mg/L?80mg/L药效最佳,故后续实验剂量设为:40mg/L和80mg/L。3.黄芪多糖对细胞迁移的影响:黄芪多糖（40mg/L、80mg/L）能促进细胞迁移,逆转DFMO（多胺合成抑制剂,2.5mmol/L）对细胞迁移的抑制（细胞迁移率黄芪多糖组与模型组比较P<0.05）。提示黄芪多糖促进细胞迁移的作用与其影响多胺有关。4.黄芪多糖对细胞迁移多胺信号通路Ca2+调节蛋白及其蛋白复合体的影响:（1）黄芪多糖（40mg/L、80mg/L）能提高Rho A、Rac1、Cav1、TRPC1、PLCγ-1蛋白表达（与空白组比较均P<0.05）,逆转DFMO对上述蛋白表达的抑制（与DFMO模型组比较均P<0.05）;（2）能提高蛋白复合体TRPC1/Rho A、TRPC1/Cav1、PLCγ-1/Rac1表达,拮抗DFMO对TRPC1/Rho A、TRPC1/Cav1、PLCγ-1/Rac1蛋白复合体抑制的作用。提示黄芪多糖促进细胞迁移的作用与其影响胞内钙库释放和TRPC1介导的胞外Ca2+内流有关。5.黄芪多糖在特定负荷下对相关指标的影响:（1）可逆转si-Cav1所致的Cav1蛋白表达降低、Ca2+水平降低和细胞迁移抑制（与si-Cav1模型组比较均P<0.05）;（2）可逆转Rho A抑制剂（Rhosin）所致的Ca2+水平降低和细胞迁移抑制（与Rhosin模型组比较均P<0.05）;（3）可逆转Rac1抑制剂（NSC23766）所致的Ca2+水平降低和细胞迁移抑制（与NSC23766模型组比较均P<0.05）。提示黄芪多糖可改善特定负荷所致的Ca2+水平降低和细胞迁移抑制。研究结论黄芪多糖是黄芪促进IEC-6细胞迁移的有效组分之一,作用机制与其影响细胞迁移多胺信号通路Ca2+调节蛋白及其复合体表达从而促进TRPC1介导的Ca2+内流有关。研究结果为探讨益气健脾中药黄芪的胃肠黏膜保护作用提供了参考。