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研究目的：以EST分析方法构建五步蛇毒腺基因表达谱，发现和鉴定凝血紊乱和出血症状毒素相关基因，为开发蛇毒基因工程药物提供序列资源。
研究方法：
1.以TRIZOL试剂提取新鲜五步蛇毒腺总RNA，以superscriptⅡ反转录酶合成cDNA第一链并以DNA多聚酶Ⅰ连续合成第二链。双链DNA经过含EcoRⅠ酶切位点接头加接，末端磷酸化并以XhoⅠ内切酶酶切，按照＜0.25kb，0.25～0.5kb，0.5～1kb，1～2kb和＞2kb5个片断大小分别回收，随后与pBluescriptⅡSK(+)载体相连转化E.coliDH10B，构建成五步蛇毒腺cDNA文库。
2.各个片断的cDNA文库中随机挑取克隆，以96孔板培养于含有100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基，过夜摇菌培养16h.碱裂解法提取DNA，利用MegaBACE1000自动测序仪从克隆5’端以T3通用引物进行单向测序。
原始峰图的碱基识别与质量评估由Phred软件(Phred-Phrap-Consedpackage)完成，碱基质量参数的域值设为Q20(99％准确度)，去除低质量序列。在利用CROSSMATCH程序屏蔽载体序列，进一步剔除接头序列，得到原始的EST序列。为了获取毒腺分泌性多肽的序列信息，保留长度小于50bp的EST序列用于后继分析。
利用拼接程序Phrap对所有高质量ESTs进行拼接，除了最小重叠区为40bp及一致性为99％，其余的参数均为默认值。随机挑取克隆5’末端测序，共获得8696条高质量表达序列标签(ESTs)，经过序列拼接和聚类，这些序列在经过功能注释后最终被聚类成2855个基因聚类。拼接后得到的克隆重叠群和单拷贝序列(称为基因聚类)以Consed软件手工检查拼接质量。所有基因聚类用BLASTX(Evalues＜10-5)和BLASTN(Evalues＜10-10)搜索GenBank的非冗余蛋白数据库和核酸序列数据库。序列注释同时根据同源性最高的注释和具体匹配序列情况而定。在非冗余蛋白数据库和核酸序列数据库中无同源性的一致性序列用以搜索dbEST数据库和hmmpfam数据库。根据标准基因词汇体系(GeneOntology，GO)，我们把具有注释信息的基因聚类进行了分类。以GO分子功能分类条目为标准，建立了毒腺基因表达谱。同时，将具有相应酶号的基因聚类进行KEGG代谢途径分析。
3.2855个基因聚类中，发现一个由74个克隆组成的基因聚类(Agkihagin)为新的金属蛋白酶基因。经反转录和巢氏PCR扩增该基因并对其进行结构分析。在酿酒酵母真核表达系统中表达Agkihagin及其改造突变体Agkihagin-Met和Agkihagin-Dis并纯化。
结果：
1.构建好的文库含有2.048×106个重组子，克隆重组率为81.3％。
2.通过大规模随机测序和生物信息学分析获得了2855个基因聚类并确定了118个毒素基因和一系列毒腺细胞蛋白相关基因。重点确定了那些毒素相关基因，其产物是导致了五步蛇咬伤中出现的凝血紊乱和出血症状主要原因。
3.克隆了新的Ⅲ型金属蛋白酶基因Agkihagin，得到其全长。在酵母真核表达系统中成功表达和纯化Agkihagin及其改造突变体。
结论：
1.该文库符合建库标准库容要求，为构建五步蛇毒腺基因表达谱和筛选新的目的基因提供了有效平台。
2.我们获取了迄今较为完整的五步蛇毒腺基因表达谱，该图谱和一些功能未知的EST序列为蛇毒的比较研究和新的毒性成分的发现提供了重要资源。重点确定的那些毒素相关基因，为在分子水平上揭示五步蛇咬伤中出现的凝血紊乱和出血症状形成机制以及其他腺体分泌现象奠定了基础。由此，必将拓展五步蛇蛇毒在医药领域的研究与应用。
3.克隆的金属蛋白酶基因与GenBank中其他蛇毒金属蛋白酶氨基酸序列同源性最高达87％，为研究蛇毒金属蛋白酶结构与功能的关系奠定了良好基础。Agkihagin及其改造突变体的成功表达与纯化为其功能研究提供了必要条件。