论文部分内容阅读
结肠癌是全球人类最常见的恶性肿瘤之一，其发生已证实与遗传、环境、饮食、运动、体重、慢性肠道炎症等多种因素有关。近年来炎症因素在结肠癌发病中的作用，特别是炎性细胞因子在其发病机理中越来越受到重视。磷脂酶A2（PLA2）是一类可水解磷脂甘油分子的分泌型酶，可催化水解磷脂产生游离脂肪酸如花生四烯酸（AA），通过环氧合酶（COX），进而引发炎症反应。近年来临床上已有使用COX-2选择性抑制剂可以有效降低结肠癌发病风险的报道。本课题组前期研究发现PLA2高表达的结肠癌患者5年生存率相对较差，消痰通腑方可通过降低COX-2的表达从而抑制结肠癌细胞SW480的增殖和迁移。临床上消痰通腑方治疗结肠癌是否通过影响PLA2的表达进而抑制COX-2而实现的呢？这是本研究需要解决的关键科学问题。 目的：通过体内和体外实验观察消痰通腑方对结肠癌细胞增殖、迁移能力的作用以及对磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）、环氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）mRNA和蛋白表达水平的影响，探讨消痰通腑方治疗结肠癌的可能的作用机制。 方法：1.构建人结肠癌SW480细胞裸鼠皮下移植瘤模型，实验分为模型对照组，阳性对照组（5-FU组）、消痰通腑方实验组（低浓度组、中浓度组、高浓度组），通过瘤重计算抑瘤率，观察肿瘤组织病理情况，采用RT-qPCR的判断肿瘤组织中PLA2、COX-2mRNA水平的变化，采用Western Blot方法检测肿瘤组织中PLA2、COX2蛋白水平的变化。 2.分别以高中低三种浓度的消痰通腑方和5-FU处理结肠癌SW480细胞，用CCK8法和平板克隆形成实验检测细胞增殖水平的改变，Transwell小室实验获取细胞迁移能力的变化，采用RT-qPCR的方法判断PLA2、COX-2水平的变化，采用Western Blot方法检测PLA2、COX-2蛋白水平的变化。 3.构建PLA2短发夹RNA质粒（sh-PLA2），培育SW480稳转细胞株，分为对照组和PLA2沉默组，分别用高剂量消痰通腑方处理，用平板克隆形成实验检测细胞增殖水平的改变，Transwell小室实验获取细胞迁移能力的变化，采用RT-qPCR的方法判断PLA2、COX-2mRNA水平的变化，采用Western Blot方法检测PLA2、COX2蛋白水平的变化。 结果：1.消痰通腑方中、高剂量组瘤重较模型对照组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01），中剂量组抑瘤率为18.49%，高剂量组抑瘤率为29.09%，5-FU组抑瘤率为31.08%。消痰通腑方低剂量组肿瘤细胞结构大致完整，几乎没有出现坏死和凋亡的情况。消痰通腑方中、高剂量组的肿瘤细胞结构不完整，出现大面积的坏死、凋亡。消痰通腑方中、高剂量处理结肠癌模型小鼠后，与模型对照组比较，中剂量组、高剂量组瘤组织中的PLA2mRNA表达量（中0.63±0.04VS1、高0.45±0.03VS1）、COX-2mRNA表达量（中0.66±0.03VS1、高0.39±0.05VS1）以及PLA2蛋白表达量（中0.4294±0.0137VS0.8722±0.0231、高0.3462±0.0124VS0.8722±0.0231）、COX-2蛋白表达量（中0.3678±0.0129VS0.6789±0.0246、高0.2578±0.0117VS0.6789±0.0246）均显著降低差异均有统计学意义，P＜0.01。消痰通腑方低剂量组与模型对照组比较PLA2、COX-2的mRNA和蛋白表达均无统计学差异（PLA2mRNA：0.86±0.03VS1；COX-2mRNA：0.82±0.04VS1；PLA2蛋白：0.7423±0.0158VS0.8722±0.0231；COX-2蛋白：0.5681±0.0195VS0.6789±0.0246），P＞0.05）。 2.消痰通腑方中剂量组、高剂量组与对照组对比,结肠癌SW480细胞相对增值率在72h、96h、120h时间段上均降低（72h：中：2.22±0.10VS3.72±0.16，P＜0.05；高：1.97±0.13VS3.72±0.16，P＜0.05）（96h：中：2.58±0.12VS4.06±0.15，P＜0.05；高：2.23±0.14VS4.06±0.15，P＜0.05）（120h：中：2.70±0.13VS4.31±0.13，P<0.05；高：2.41±0.15VS4.31±0.13，P＜0.05），而低剂量组在96h、120h时间段上与对照组相比细胞相对增值率降低（96h：2.89±0.14VS4.06±0.15，P<0.05）（120h：2.97±0.15VS4.31±0.13，P＜0.05）。在细胞克隆形成数目以及细胞迁移数目方面，消痰通腑方高剂量组远远少于对照组（克隆数：64±9VS242±11，P<0.01；迁移数：66±8VS217±16，P＜0.01），中剂量组和低剂量组也少于对照组（克隆数：中：122±8VS242±11，P<0.05；低169±6VS242±11，P<0.05；迁移数：中：101±9VS217±16，P＜0.05；低143±6VS217±16，P＜0.05）。高剂量组消痰通腑方PLA2、COX-2mRNA和蛋白表达水平与对照组相比均明显下调（P＜0.01）；中剂量组消痰通腑方在PLA2、COX-2mRNA表达水平对比对照组均明显下调（P＜0.01），在PLA2、COX-2蛋白表达量上对比对照组降低（P＜0.05）；低剂量组消痰通腑方在PLA2、COX-2mRNA表达水平对比对照组均明显下调（P＜0.01）。 3.干扰PLA2后结肠癌SW480细胞的PLA2、COX-2的mRNA及蛋白表达量对比对照组均下降（P＜0.05）；通过消痰通腑方处理结肠癌SW480细胞后，PLA2、COX-2的mRNA和蛋白表达量对比对照组均下降（P＜0.05）；消痰通腑方干预干扰PLA2的结肠癌SW480细胞，其PLA2和COX-2的mRNA、蛋白表达量对比对照组下降（P＜0.05）。在PLA2、COX-2mRNA和蛋白表达量上XTTFR处理和sh-PLA2处理之间有交互作用，两者共同处理结肠癌SW480细胞后可使PLA2，COX-2mRNA及蛋白表达量下降明显。 结论：消痰通腑方能有效降低结肠癌模型裸鼠的移植瘤重量，促进肿瘤细胞的坏死、凋亡；降低结肠癌SW480细胞的增殖与迁移能力，降低其PLA2、COX-2的表达水平。消痰通腑方治疗结肠癌的作用机制可能与下调PLA2进而影响COX-2的表达有关。