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背景膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,其术后复发率相当高,在保留膀胱的手术治疗后约有50%～70%的患者术后复发。经国内外泌尿外科学者多年来不断探索,发现膀胱内定期灌注化疗药物,可以有效减少和延缓膀胱肿瘤的复发,提高患者生存率。因此,手术前后采用化学治疗以及晚期膀胱肿瘤采用化学治疗是当前膀胱癌治疗疗研究的重点。选择合适的化疗药物也是当前膀胱癌治疗研究的热点。近年来,雷公藤抗肿瘤的作用被越来越重视,但由于雷公藤成分复杂人们迫切希望能从中分离出有效的单体成分,找到一种理想的抗肿瘤单体。本课题就雷公藤最新提取物去甲泽拉木醛(Demethylzeylasteral,Dzy,T-96)对膀胱癌细胞的作用进行研究。第一部分去甲泽拉木醛对T24膀胱癌细胞株细胞毒性试验研究目的:了解去甲泽拉木醛对T24膀胱癌细胞株细胞毒性,诱导细胞凋亡及对生长周期的影响,从而了解去甲泽拉木醛对膀胱癌细胞和的毒性,为进一步研究选择合适的药物浓度。方法:用不同浓度的去甲泽拉木醛和吡柔比星作用于T24膀胱癌细胞,用MTT法测定药物作用后细胞活性,计算抑制率。结果:去甲泽拉木醛和吡柔比星对T24膀胱癌细胞的杀伤率随着药物浓度的升高而升高,吡柔比星在浓度大于一定值(1ug/ml)后,出现一个平台期。结论:结合药物代谢动力学数据,分别选择去甲泽拉木醛和吡柔比星两个浓度(去甲泽拉木醛低浓度组20ug/ml,去甲泽拉木醛高浓度组40ug/ml,吡柔比星低浓度组0.03ug/ml,吡柔比星高浓度组0.06ug/ml)进行随后的研究。第二部分去甲泽拉木醛对T24膀胱癌细胞株药效强度试验研究目的:以吡柔比星为参照,探讨去甲泽拉木醛对T24膀胱癌细胞株作用的浓度-效应关系及时间-效应关系。了解各组对T24膀胱癌细胞株诱导凋亡的效果,并研究两者之间对膀胱癌细胞株的杀伤作用有无差异。方法:分别使用两个不同浓度的去甲泽拉木醛(20μg/ml,40μg/ml)和吡柔比星(0.03μg/ml,0.06μg/ml)处理T24膀胱癌细胞株,连续使用3天用MTT法测定细胞活性,计算抑制率。结果:去甲泽拉木醛组和吡柔比星组对T24膀胱癌细胞的杀伤率随时间的延长而增高。两个浓度组的去甲泽拉木醛和吡柔比星对T24膀胱癌细胞的杀伤率的差异在第三天有统计学意义(低浓度组:0.624±0.035 vs 0.563±0.032,P=0.015;高浓度组:0.792±0.026 vs 0.672±0.028,P<0.001)。在第一天和第二天,两个浓度组的去甲泽拉木醛和吡柔比星的杀伤率无统计学意义。(低浓度组:第一天0.152±0.063 vs 0.127±0.055,P=0.456,第二天0.504±0.031 vs 0.507±0.042,P=0.879;高浓度组:第一天:0.266±0.068 vs 0.231±0.057,P=0.256,第二天0.585±0.053 vs 0.594±0.039,P=0.660)。结论:第三天,去甲泽拉木醛对T24膀胱癌细胞株的杀伤作用在对应浓度情况下与吡柔比星的作用有差异。第一天和第二天,两者相对应浓度组的杀伤作用近似。第三部分通过Annexin V和PI双染色,运用流式细胞学检测去甲泽拉木醛作用于T24膀胱癌肿瘤细胞检测凋亡研究目的:研究去甲泽拉木醛作用于肿瘤细胞产生作用的主要方式(杀死细胞还是诱导细胞凋亡),探讨去甲泽拉木醛作用于肿瘤细胞作用的可能机制。方法:用AnnexinV和PI对两不同浓度组的去甲泽拉木醛(20μg/ml,40μg/ml)和吡柔比星(0.03μg/ml,0.06μg/ml)分别处理过后的细胞进行双染色,然后经流式细胞仪筛选,分辨其中凋亡与杀伤死亡细胞。结果:去甲泽拉木醛:低浓度组:坏死细胞8.29%±1.03,凋亡细胞比例14.37%±2.50;高浓度组:坏死细胞27.935%±3.80,凋亡细胞55.105%±9.75;比柔比星:低浓度组:坏死细胞64.41%±15.53,凋亡细胞2.16%±1.91;高浓度组:坏死细胞96.25%±2.28,凋亡细胞2.81%±2.49结论:去甲泽拉木醛主要通过诱导肿瘤细胞凋亡的途径作用于肿瘤细胞第四部分去甲泽拉木醛对T24膀胱癌细胞株作用中,与bax和caspase-3表达关系的实验研究目的:探讨去甲泽拉木醛作用于T-24膀胱癌细胞的可能机制。方法:用免疫组化定性测定去甲泽拉木醛处理后的T24细胞内bax,caspase-3表达情况,与未处理的T24膀胱癌细胞(阴性对照)和吡柔比星处理过后的T24膀胱癌细胞(阳性对照)内bax,caspase-3含量相比较对照。结果:去甲泽拉木醛处理过后的T24膀胱癌细胞株中bax表达呈阳性,caspase-3表达呈阳性。吡柔比星处理过后的T24细胞中bax呈阳性,caspase-3表达呈阳性。结论:去甲泽拉木醛可诱导T24膀胱癌细胞株凋亡,激活bax基因表达和启动caspase-3凋亡通路是其可能的机制之一。