凝血酶是凝血系统中重要因子,位于外源性和内源性凝血途径的共同通路中,在凝血系统的激活中处于关键和核心位置。已有研究表明,凝血酶也是肿瘤发生发展过程中的重要因子。凝血酶受体PAR1-蛋白酶活化受体1(protease-activated receptor 1)是其最重要的受体,介导了凝血酶促进肿瘤血管生成、侵袭转移、生长等重要过程。本课题以肺癌细胞为研究对象,观察凝血酶及其受体促进肺癌发生和发展的作用并探讨其可能的机制。我们首先观察了凝血酶在体内对肺癌发生发展的促进作用。凝血酶可以显著促进小鼠Lewis肺癌的生长,与对照组相比,凝血酶组(0.5U/只、1U/只)瘤重增长率分别为37%、30%,差异显著(p <0.05,p <0.01)。凝血酶抑制剂:新型凝血酶抑制剂(NTH)和水蛭素可以抑制Lewis肺癌的生长,降低其生长速度;同时,新型凝血酶抑制剂和水蛭素可以显著抑制Lewis肺癌的肺转移,与对照组相比,其中新型凝血酶抑制剂组的肺重(0.143g)显著低于对照组(0.185g)(p < 0.05),新型凝血酶抑制剂组的肺结节数(9.2个)显著少于对照组(17.5个)(p < 0.05)。病理切片同样可见,凝血酶抑制剂可抑制肿瘤的侵袭转移。并且,至实验结束时,水蛭素组的动物大部分死亡,2.5mg/kg水蛭素组七只动物死亡四只,而5mg/kg水蛭素组动物只有一只存活,而新型凝血酶抑制剂组八只动物仅一只死亡,且从死亡动物解剖结果来看,水蛭素组动物腹腔内大量出血,这可能是动物死亡主要原因,而新型凝血酶抑制剂组动物未见体内有明显的出血,说明其出血副作用已大大降低。在Glc-82移植瘤实验观察到,凝血酶可降低荷瘤小鼠的体重、增加瘤重占体重比、部分凝血酶组小鼠肺转移增多、荷瘤鼠的生存时间缩短;Western印迹结果显示,凝血酶可促进肿瘤组织ERK的激活,促进FAK的表达,并且抑制抑癌蛋白PTEN的表达。体内实验结果显示,凝血酶可以促进肺癌的发展。我们进一步探讨了凝血酶在体外促进肺癌细胞侵袭转移的作用机制。细胞粘附实验观察到液态环境中的凝血酶没有显著促进肺癌细胞Glc-82及PLA-801D粘附至细胞外基质的作用,但可以激活整合素。包被的凝血酶可以促进肺癌细胞Glc-82、PLA-801D的粘附特性,将凝血酶的天然抑制剂水蛭素(抑制凝血酶的催化结构域)与凝血酶共孵育后包被于细胞培养板,凝血酶的促粘附作用被抑制,而先将凝血酶进行包被,然后加入水蛭素则不能抑制此促粘附作用,该结果提示包被的凝血酶可能发生了空间构象的变化,其促肿瘤细胞粘附作用不依赖于其催化结构域;我们还观察到PAR1抗体及整合素αⅤ的抗体不抑制包被凝血酶的促粘附进作用,但是含RGD序列的整合素配体竞争性抑制多肽GRGDS可以拮抗此促进作用,说明在此促粘附作用中有整合素的参与,但可能是除了整合素αⅤ之外的其它整合素。Western印记实验结果也观察到包被的凝血酶可以激活整合素,此激活作用可以被GRGDS所抑制,以上结果提示我们,包被的凝血酶可能通过构象改变暴露出RGD序列激活整合素,从而促进肺癌细胞的粘附,但是激活的整合素可能是αⅤ之外的亚型。凝血酶受体激动多肽可以促进肺癌细胞粘附至细胞外基质,并且可以激活整合素,而且整合素αⅤ抗体及GRGDS可以抑制此激活作用。细胞免疫荧光共聚焦实验没有观察到凝血酶及PAR1激动多肽引起PAR1和整合素αⅤ的共定位。我们还观察了凝血酶PAR1受体表达情况与肿瘤干细胞的关系,以期探讨凝血酶可否通过肿瘤干细胞促进肺癌的发展。实验结果可见,PLA-801D细胞对鼠尾胶原和纤黏连蛋白的粘附作用均明显强于PLA-801C细胞(p < 0.01)。PLA-801D细胞迁移能力明显强于PLA-801C细胞(p < 0.01)。PLA-801D细胞PAR1的表达是PLA-801C细胞的3.41倍。在单细胞克隆形成实验中,PLA-801D可产生4种单细胞克隆,其中1种在传单细胞亚克隆后仍可形成如上4种克隆,而PLA-801C细胞只能形成3种单细胞克隆,且未发现有完全分化能力的细胞克隆。PLA-801D细胞的生物力学重塑能力也明显高于PLA-801C细胞(p < 0.05)。为探讨凝血酶及其受体PAR1在促肿瘤进程中的作用,我们构建了PAR1的真核表达载体,并包装了带有PAR1基因的腺病毒;同时构建了携带PAR1干涉片段的表达载体,为后续的研究工作奠定基础。结论:凝血酶促进Lewis肺癌的生长、促进肺癌Glc-82移植瘤的恶性进展,而凝血酶抑制剂抑制Lewis肺癌的生长,并显著抑制Lewis肺癌的侵袭转移,表明凝血酶可促进Lewis肺癌的生长和侵袭转移,并且凝血酶新型抑制剂的出血副作用比水蛭素大为降低。凝血酶促进肿瘤细胞粘附特性的研究表明,包被的凝血酶可能通过构象改变暴露RGD序列,借此序列激活整合素,从而促进肺癌细胞Glc-82、PLA-801D的粘附。液态环境下的凝血酶未见有明显的促细胞粘附作用,但可以激活整合素,其作用方式仍需更多地实验工作来探明。PAR1激动多肽可以促进肺癌细胞Glc-82、PLA-801D对细胞外基质的粘附,并可能通过细胞内途径激活整合素,并有整合素αⅤ亚型的参与。这些实验结果说明PAR1和整合素均参与了凝血酶的促肿瘤转移过程,凝血酶在不同的状态下可能通过不同的方式激活PAR1和整合素。具有高转移潜能的PLA-801D细胞PAR1的表达高于PLA-801C细胞,并且含有一小群具有自我更新和分化能力的肿瘤干细胞,且该细胞株的生物力学重塑性较好,提示该细胞株对细胞外基质的重塑性能较强,但PAR1的表达与肿瘤干细胞的关系,及凝血酶与肿瘤干细胞的关系仍需进一步研究。构建了PAR1的真核表达载体,包装了带有PAR1基因的重组腺病毒,构建了携带PAR1干涉序列的表达载体,建立了PAR1稳定下调的PLA-801D细胞株。