论文部分内容阅读
目的为减少小龙虾相关食源性疾病的产生,需寻找一种有效的控制小龙虾初始污染菌数的方法,以避免相关食品卫生问题发生、确保小龙虾相关产品的卫生质量,提供小龙虾抑菌清洗剂开发的理论依据。方法选择江苏南京浦口、宿迁泗洪、苏州太湖东山的小龙虾为实验对象,取小龙虾整体、表面、尾肉为样品,利用传统培养基鉴定法与宏基因组测序法探究小龙虾的细菌污染情况及物种丰度,确定主要污染菌为Citrobacter(柠檬酸杆菌属)、Aeromonas(气单胞菌属)、Klebsiella(克雷伯氏菌属)。分别利用 SAEW、AEW、0.5%PLA、1%PLA、2%PLA、0.5%PLA+SAEW和1%PLA+SAEW处理成膜能力强的Citrobacter freundii(弗氏柠檬酸杆菌)C6、Aeromonas rivipollensis(里氏气单胞菌)A5与Klebsiella oxytoca(产酸克雷伯氏菌)K6以及常见的食源性致病菌——Vibrio parahemolyticus(副溶血性弧菌)CICC21617的浮游菌与生物膜5、10、20、30、60 min,利用菌落计数、胞外ATP浓度测定、SEM、CLSM、ATR-FTIR探究抑菌剂的清洗效果。选择最佳处理时间振荡清洗小龙虾,记录表面V.parahemolyticus CICC21617及菌落数量变化,结合宏基因组测序比较处理组之间的物种丰度变化。结果(1)未经预清洗的小龙虾携带菌数较多,不同样品的菌落总数在6.0(lg(CFU/g)以上,小龙虾整体与表面之间的物种丰度相似性高。菌种分离结果显示小龙虾主要污染菌为Citrobacter、Klebsiella、Hafnia alvei(蜂房哈夫尼菌属)、Exiguobacterium(微小杆菌属)、Aeromonas。宏基因组测序法得到的物种丰度高于传统培养基鉴定法,主要有Flavobacterium(黄杆菌属)、Acinetobacter(不动杆菌属)、Chryseobacterium(金黄杆菌属)、Aeromonas、Pseudomonas(假单胞菌属)和Shewanella(希瓦氏菌属)。因此,确定小龙虾主要污染菌为Citrobacter、Aeromonas、Klebsiella。(2)C.freundii C6、A.rivipollensis A5、K.oxytoca K6具有强粘附成膜能力,其生物膜在培养3d时均达到成熟期。抑菌剂均能抑制这三株菌的浮游菌体及生物膜,但生物膜内菌体对抑菌剂的耐受能力高于浮游菌体,且SAEW的抑菌效果不太理想。0.5%PLA+SAEW和1%PLA+SAEW的抑菌效果分别达到了 1%PLA与2%PLA的处理效果。经1%PLA+SAEW处理的浮游菌体膜结构褶皱、破损程度较单一抑菌剂严重,菌体红色荧光强度较高伴随菌体自聚、抱团现象,且菌体胞内ATP外泄。1%PLA+SAEW作用30 min时使生物膜胞外多糖含量降低,膜内菌体皱缩呈亮红色荧光且胞内ATP外泄、ATR-FTIR的峰位置发生位移。(3)V.parahemolyticus CICC21617具有强粘附成膜能力,生物膜成熟期为3 d。抑菌剂均能有效抑制其浮游菌体及生物膜,同样地,生物膜内菌体对抑菌剂的耐受能力显著高于浮游菌体。1%PLA+SAEW作用30 min时使生物膜结构遭到破坏并且膜内菌体全部失活,膜呈红色荧光且表面物质结构发生变化。能够使依附于小龙虾表面的V.parahemolyticus CICC21617完全失活。(4)不同抑菌剂对小龙虾表面的振荡清洗效果显著,1%PLA+SAEW使表面菌数减少了 3.95(lg(CFU/g)),效果最佳。同时Flavobacterium、Shewanella、Aeromonas等优势菌属的物种丰度有所下降。一些次要菌属如Bacteroides、Pseudomonas的相对丰度升高。结论小龙虾整体与表面的物种相似性高,其初始污染菌群主要与水体环境有关。污染菌的生物膜内菌体活力高于浮游菌体。PLA与SAEW复配的抑菌作用是通过破坏菌体的细胞膜使其内容物泄出进而失活;对生物膜的抑菌机理是通过溶解胞外多糖、改变生物膜表面物质成分使膜内菌体的细胞膜受损。1%PLA+SAEW作用30 min能够有效降低小龙虾表面菌数、杀死接种于小龙虾表面的V.parahemolyticus CICC21617、使其物种多样性发生变化,是一种有效的清洗减菌手段。