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牛结节性皮肤病（Lumpy skin disease，LSD）又称牛结节性皮炎或块状皮肤病或牛疙瘩皮肤病，是由羊痘病毒属（Capripoxvirus）的牛结节性皮肤病病毒（Lumpy skin disease virus，LSDV）引起牛的一种急性、亚急性接触性传染病。各种品种和年龄的牛均易感，发病率在2%~45%，死亡率达10%，甚至更高，给经济带来较大的损失。该病被世界动物卫生组织(OIE)列为必须通报的传染病，《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》I类传染病，因此，在该病流行的国家和地区，其易感动物及动物源性产品出口将受到世界各贸易国的严格限制，极大的影响畜牧业和国际贸易的发展。针对该病主要采用疫苗防治，尚无药物可治疗，且该病原现有的检测方法单一或不能较好的鉴别检测。
本研究基于LSDV的ORF001、ORF101和ORF126基因，建立了羊痘病毒属病毒的LAMP检测方法，牛结节性皮肤病病毒通用型TaqMan MGB实时荧光定量PCR方法和牛结节性皮肤病病毒野毒株与疫苗株双重TaqMan MGB实时荧光定量PCR方法，并应用建立的方法，对重庆、新疆、黑龙江、云南等地区的牛、羊进行羊痘病毒流行病学调查研究，试验从LSDV核酸阳性的媒介生物中成功分离出1株牛结节性皮肤病病毒。研究针对LSDV ORF005和ORF132蛋白分别构建了真核表达载体和重组穿梭载体，以Cellfectin Reagent介导下，转染Sf9昆虫细胞，并在Sf9昆虫细胞中获得成功表达，为牛结节性皮肤病血清学方法的建立和疫苗研究奠定了基础。
①建立了CaPV-LAMP检测方法，可特异、敏感的检测羊痘病毒属病毒。该方法对LSDV的最低检出限为14.7TCID50，比常规PCR高100倍，比荧光定量PCR法略低，CaPV-LAMP检测方法具有良好的稳定性和重复性，其可视法不需要特殊仪器，可肉眼直接判读结果，适用于临床上CaPV的现场快速筛查。
②建立了牛结节性皮肤病病毒通用型TaqMan MGB实时荧光定量PCR方法，方法最低检出量为21.6拷贝/μL，可特异、敏感的鉴别检测羊痘病毒属病毒，重复性较好，扩增效率为95.3%。在临床样本中，最低可检出3.8pg/mL的病毒DNA。研发的试剂盒稳定性好，储存于4℃可保存6个月，-20℃至少可保存14个月。应用于临床样本的检测，显示该方法可特异地检测牛羊血液、皮肤、淋巴结等样品中的LSDV核酸，适用于牛结节性皮肤病的诊断和流行病学调查。
③建立了牛结节性皮肤病病毒野毒株与疫苗株的双重TaqMan MGB实时荧光定量PCR方法，可特异、敏感地鉴别LSDV野毒株与疫苗株，对山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛痘病毒、羊口疮病毒等均无特异扩增，方法对野毒株和疫苗株病毒核酸的最低检出量分别为22.6拷贝/μL和19.7拷贝/μL，扩增效率为99.5%，并研发了相应的标准化诊断试剂盒。对试验感染LSDV野毒株的牛EDTA抗凝血进行检测，最低检出限为9DPI。方法特异、敏感、简便、快速，可为牛结节性皮肤病的疫情监测和弱毒疫苗免疫监控提供鉴别技术手段。
④针对LSDV的ORF005和ORF132基因进行系统分析，密码子优化，设计引物，扩增目的基因，将目的基因回收、连接到pFastBac-HTB载体上，转化，构建真核表达载体pFastBac-HTB-ORF005和pFastBac-HTB-ORF132。分别将重组质粒pFastBac-HTB-ORF005、pFastBac-HTB-ORF132转入E.coli DH10Bac感受态细胞，构建重组穿梭质粒rBacmid-ORF005和rBacmid-ORF132，以Cellfectin Reagent介导，在Sf9昆虫细胞中进行了真核表达。经Western blot分析和IFA鉴定，ORF005和ORF132蛋白在Sf9昆虫细胞中均获得成功表达，为新型疫苗的研制和抗体诊断方法的建立奠定了基础。
⑤应用本研究建立的实时荧光定量PCR方法、CaPV-LAMP方法及OIE推荐的常规PCR方法，分别对新疆、云南、黑龙江、重庆等地区牛、羊的羊痘病毒属病毒流行情况进行调查研究。从新疆伊犁边境地区牛结节性皮肤病病毒核酸检测阳性的媒介生物中进行病毒分离，接种MDBK细胞，盲传3代后，成功分离出1株牛结节性皮肤病病毒，命名为XJ1917株，经测序分析，本次分离的牛结节性皮肤病病毒与LSDV Neethling疫苗株同源性为99%，并在ORF126区域存在27个碱基缺少，3个位点的突变。经TCID50测定，XJ1917株第5代细胞病毒液的滴度为3.65×106TCID50/mL。
本研究基于LSDV的ORF001、ORF101和ORF126基因，建立了羊痘病毒属病毒的LAMP检测方法，牛结节性皮肤病病毒通用型TaqMan MGB实时荧光定量PCR方法和牛结节性皮肤病病毒野毒株与疫苗株双重TaqMan MGB实时荧光定量PCR方法，并应用建立的方法，对重庆、新疆、黑龙江、云南等地区的牛、羊进行羊痘病毒流行病学调查研究，试验从LSDV核酸阳性的媒介生物中成功分离出1株牛结节性皮肤病病毒。研究针对LSDV ORF005和ORF132蛋白分别构建了真核表达载体和重组穿梭载体，以Cellfectin Reagent介导下，转染Sf9昆虫细胞，并在Sf9昆虫细胞中获得成功表达，为牛结节性皮肤病血清学方法的建立和疫苗研究奠定了基础。
①建立了CaPV-LAMP检测方法，可特异、敏感的检测羊痘病毒属病毒。该方法对LSDV的最低检出限为14.7TCID50，比常规PCR高100倍，比荧光定量PCR法略低，CaPV-LAMP检测方法具有良好的稳定性和重复性，其可视法不需要特殊仪器，可肉眼直接判读结果，适用于临床上CaPV的现场快速筛查。
②建立了牛结节性皮肤病病毒通用型TaqMan MGB实时荧光定量PCR方法，方法最低检出量为21.6拷贝/μL，可特异、敏感的鉴别检测羊痘病毒属病毒，重复性较好，扩增效率为95.3%。在临床样本中，最低可检出3.8pg/mL的病毒DNA。研发的试剂盒稳定性好，储存于4℃可保存6个月，-20℃至少可保存14个月。应用于临床样本的检测，显示该方法可特异地检测牛羊血液、皮肤、淋巴结等样品中的LSDV核酸，适用于牛结节性皮肤病的诊断和流行病学调查。
③建立了牛结节性皮肤病病毒野毒株与疫苗株的双重TaqMan MGB实时荧光定量PCR方法，可特异、敏感地鉴别LSDV野毒株与疫苗株，对山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛痘病毒、羊口疮病毒等均无特异扩增，方法对野毒株和疫苗株病毒核酸的最低检出量分别为22.6拷贝/μL和19.7拷贝/μL，扩增效率为99.5%，并研发了相应的标准化诊断试剂盒。对试验感染LSDV野毒株的牛EDTA抗凝血进行检测，最低检出限为9DPI。方法特异、敏感、简便、快速，可为牛结节性皮肤病的疫情监测和弱毒疫苗免疫监控提供鉴别技术手段。
④针对LSDV的ORF005和ORF132基因进行系统分析，密码子优化，设计引物，扩增目的基因，将目的基因回收、连接到pFastBac-HTB载体上，转化，构建真核表达载体pFastBac-HTB-ORF005和pFastBac-HTB-ORF132。分别将重组质粒pFastBac-HTB-ORF005、pFastBac-HTB-ORF132转入E.coli DH10Bac感受态细胞，构建重组穿梭质粒rBacmid-ORF005和rBacmid-ORF132，以Cellfectin Reagent介导，在Sf9昆虫细胞中进行了真核表达。经Western blot分析和IFA鉴定，ORF005和ORF132蛋白在Sf9昆虫细胞中均获得成功表达，为新型疫苗的研制和抗体诊断方法的建立奠定了基础。
⑤应用本研究建立的实时荧光定量PCR方法、CaPV-LAMP方法及OIE推荐的常规PCR方法，分别对新疆、云南、黑龙江、重庆等地区牛、羊的羊痘病毒属病毒流行情况进行调查研究。从新疆伊犁边境地区牛结节性皮肤病病毒核酸检测阳性的媒介生物中进行病毒分离，接种MDBK细胞，盲传3代后，成功分离出1株牛结节性皮肤病病毒，命名为XJ1917株，经测序分析，本次分离的牛结节性皮肤病病毒与LSDV Neethling疫苗株同源性为99%，并在ORF126区域存在27个碱基缺少，3个位点的突变。经TCID50测定，XJ1917株第5代细胞病毒液的滴度为3.65×106TCID50/mL。