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目的探讨Wntl0b在百草枯致肺纤维化时肺上皮细胞发生上皮-间质转化过程中的作用及其机制。方法利用腹腔注射百草枯的方法,构建大鼠肺纤维化模型,验证上皮-间质转化的发生,并检测wnt/β-catenin信号通路关键因子的表达水平;在体外,分别使用百草枯(500μmol/ml)、Wnt10b重组蛋白(100ng/ml)处理人肺上皮细胞(16HBE)72h后,采用Westem Blot和qRT-PCR检测上皮细胞标志E-cadherin,成纤维细胞标志Vimentin、α-SMA、Wntl0b以及wnt/β-catenin信号通路蛋白表达水平的变化,验证上皮-间质转化模型的建立及wnt/β-catenin信号通路的激活。设计针对Wnt10b的siRNA片段并构建慢病毒载体转染16HBE细胞,后加入百草枯继续培养72h,检测E-cadherin及Vimentin、α-SMA的蛋白和基因水平,以及wnt/β-catenin信号通路关键蛋白的表达水平,观察Wnt10b因子对百草枯诱导的肺上皮细胞上皮-间质转化过程的影响并探索其机制。结果1、在体内,百草枯诱导大鼠肺上皮细胞发生上皮-间质转化,并激活wnt/β-catenin信号通路。大鼠腹腔注射百草枯(20 mg/kg)后28天,取肺组织制作石蜡切片,HE染色及Masson染色发现肺泡结构明显破坏,肺间质增厚,其中胶原沉积明显增加。Western Blot和qRT-PCR分别检测肺组织上皮细胞标志物E-cadherin的蛋白及基因表达水平发现百草枯组相对于对照组明显降低,而成纤维细胞标志Vimentin、α-SMA的表达水平显著升高,差异具有统计学意义,说明百草枯成功诱导大鼠肺上皮细胞发生上皮-间质转化,验证肺纤维化的发生。同时,qRT-PCR结果显示,与对照组相比,PQ组β-catenin和MMP-2表达水平显著升高,差异具有统计学意义,Wnt信号通路下游蛋白Cyclin D1,Axin2,MMP-7的基因表达水平显著升高,差异具有统计学意义,提示在此过程中wnt/β-catenin信号通路的激活,可能参与调控肺上皮细胞上皮-间质转化的发生发展过程。2、在体外,百草枯诱导人肺上皮细胞发生上皮-间质转化,wnt/β-catenin信号通路激活,Wnt10b表达明显增加。与对照组相比,百草枯处理后,E-cadherin的蛋白及基因表达水平降低,而Vimentin、α-SMA的表达水平明显升高,说明百草枯可诱导16HBE发生上皮-间质转化。同时,PQ组中β-catenin表达明显上调,且wnt/β-catenin信号通路的下游蛋白基因表达水平明显上调,验证wnt/β-catenin信号通路激活。另外,Western Blot及qRT-PCR结果表明,PQ组中Wnt10b的表达较对照组明显增加,差异具有统计学意义。3、Wnt10b参与调控百草枯诱导的上皮-间质转化过程。Wnt10b重组蛋白处理细胞后,实验组E-cadherin的表达水平与对照组相比明显降低,而Vimentin、α-SMA以及β-catenin的表达水平较对照组明显升高,说明Wnt10b可诱导HBE发生上皮-间质转化,并激活了经典Wnt信号通路。使用Wnt10b的siRNA片段进行目的基因敲减,再用百草枯(50μmol/mL)处理72h,发现siRNA-慢病毒转染组细胞上皮细胞标志E-cadherin的蛋白及mRNA表达水平较PQ组升高,而成纤维细胞标志Vimentin、α-SMA的蛋白及mRNA表达水平降低,差异具有统计学意义,说明百草枯所致肺上皮细胞EMT过程被阻断。结论1.腹腔注射百草枯可诱导大鼠发生肺纤维化,肺上皮细胞发生上皮-间质转化,并激活wnt/β-catenin信号通路。2.百草枯可诱导人肺上皮细胞发生上皮-间质转化,激活wnt/β-catenin信号通路,Wnt10b表达水平升高。3.Wnt10b能够激活wnt/β-catenin信号通路诱导肺上皮细胞上皮-间质转化;靶向下调Wnt10b后,PQ诱导的wnt/β-catenin信号通路的激活被抑制,百草枯诱导的上皮-间质转化过程被逆转,表明Wnt1Ob可能通过激活wnt/β-catenin信号通路,参与调控百草枯致肺纤维化的发生发展,Wnt10b可能有望成为百草枯中毒药物治疗的潜在靶点。