第一部分鼻咽癌血管生成的分子机制:信号传导通路的不协调活化目的:在肿瘤的生长过程中,血管生成起着关键的作用,它提供丰富的养分和营养物质;并且为肿瘤的浸润及转移创造条件。肿瘤细胞释放的促血管生成因子作用于宿主内皮细胞,促进新血管的生成。血管内皮生长因子(VEGF)和酪氨酸激酶受体(KDR)在血管生成中起着重要作用。而血管的成熟和稳定又主要靠酪氨酸受体另一种亚家族Tie2和其配体血管生成素(Angiopioetins)维持。这两条信号传导途径是目前认为最直接参与新血管生成的血管内皮细胞特异的途径。鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)具有生长快和转移早的特性,也是一种强的血管依赖性肿瘤。血管生成是其恶性化的第一步,而众多的促血管生成因子和抗血管生成因子参与了血管生成的过程。因此,以血管生成信号传导通路为靶向的抗血管治疗可能是一种很有潜力的抗肿瘤浸润、转移和术后复发的治疗方法。但是,在血管生成过程中,许多信号传导分子机制目前还不清楚,本研究采用逆转录聚合酶联方法和蛋白印记方法评估VEGF/KDR和Angiopoietins/Tie2在鼻咽癌中的表达,目的是探索在鼻咽癌生长及转移中这些促血管生成细胞因子及受体作用的分子机理。方法:1,对象:我院和浙江大学附属第一医院2004年10月至2006年11月鼻内窥镜下切取的23例NPC标本,分别切取癌组织23例、癌边缘(距癌组织1cm以内)23例和远离癌的鼻咽部组织(距癌组织5cm以上)23例,正常鼻咽部组织24例(均为正常人鼻咽部组织)。切取的标本即刻放置液氮中冷冻并移置-80℃冰箱保存备用。本组病人年龄26-68(平均50.86±12.78)。所有标本均经H-E染色,病理证实临床均为鼻咽癌诊断,其中镜下脉管浸润7例,同时伴有颈部淋巴结转移7例,按1997年UICC分期方法Ⅰ-Ⅱ期18例,Ⅲ-Ⅳ期5例。2,逆转录聚合酶联反应:用Trizol试剂从切除标本分离RNA。标本称重、冰冻后用研钵在Trizol试剂中研磨,分光光度仪测定总RNA浓度。加1μl DNase取出污染的DNA分子。1μg总RNA用于逆转录。产物cDNA 2μl和特异引物Ang-1、Ang-2、VEGF、KDR、Tie2和内参照引物GAPDH进行聚合酶联反应。1.5%琼脂糖胶分离13μl PCR产物,溴化乙腚染色。Koda Digital Science 1S 2.0 DNA分析软件系统对进行PCR产物半定量分析。3,蛋白印迹:样本在裂解液中匀浆。加入SDS上样缓冲液煮沸5分钟。每个加样孔上样量为50μg,SDS-PAGE电泳分离蛋白(6%胶分离Tie2和KDR,8%胶分离Ang1、Ang2和VEGF)。之后将分离的蛋白转移至PVDF膜(1mA/cm 1.5小时)上。丽春红染色确定蛋白转移的情况,5%脱脂牛奶(TBST配制)封闭PVDF膜1.5小时,加入一抗4℃过夜;TBST洗膜3╳ 15min,加入二抗(1:1000)孵育1小时,按上述方法洗膜。加显影剂ECL,压片曝光显影。4,免疫组织化学:甲醛固定石蜡包埋标本连续切片,厚约4-6mm,经二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水,抗原修复。3%过氧化氢5分钟消除内源性过氧化酶活性,10%羊血清封闭非特异抗原结合位点后,加入鼠抗CD34单克隆抗体(1:25)37.4℃孵育1小时,按HRP标记手册操作。选取5个200×视野进行CD34阳性细胞计数。5,统计学处理:所有计量数据均以平均值±标准差(x±s)表示,RT-PCR吸光度分析和血管密度分析均采用方差分析。SPSS11.0分析软件进行数据分析。p<0.05表示存在差异。结果:1、两条通路的表达与肿瘤血管密度的关系:本实验中证实VEGF/KDR和Angiopoietins/Tie2两条信号传导通路在所有的NPC标本中均有激活。Ang1在所有组中均有表达,且无明显的差异,但在NPC组织及癌旁鼻咽部中的表达存在升高趋势;Ang2在癌组织和癌旁鼻咽部中的表达明显增高于远离癌的鼻咽部和正常人鼻咽部组织组比较,p<0.01;VEGF的表达在癌组织中最高,与其他组比较p<0.05;KDR和Tie2的表达在各组中不存在明显的差异,但是,在癌组织和癌旁组织中还是存在明显高的吸光条带。在NPC组织中的血管生成因子及其受体的蛋白合成也是明显活跃的,这与他们在基因转录水平的高低是一致的。在癌组织中,VEGF和Ang1的蛋白含量明显高于正常鼻咽部组织,而其相应的受体KDR和Tie2表达随之升高;而在癌旁组织中,KDR和Ang2的表达明显升高。免疫组化方法检测微血管密度的结果表明,在癌组织及癌旁鼻咽部中的血管密度明显高于正常鼻咽部和远离癌的鼻咽部组,p<0.01。本实验中也发现,VEGF和Ang2的表达与微血管的密度有密切的关系,同时其受体也有不同程度的表达。说明在NPC血管生成中,VEGF/KDR和Angiopoietins/Tie2两条通路的活化起着关键的作用。2、NPC的浸润性及转移与血管生成的信号传导通路活化的关系血管生成是NPC侵袭和转移所必需的。与NPC侵袭及转移相关的因素包括鼻咽部脉管是否存在癌栓和肿瘤的病理分级。本研究分析了VEGF/KDR和Angiopoietins/Tie2两条信号传导通路与肿瘤侵袭和转移相关因素的关系,发现在有脉管癌栓的标本中,VEGF、Ang2和Tie2的表达明显高于无癌栓的标本,p<0.05(见表1)。在伴有颈部淋巴结转移的标本中,VEGF和Ang2的表达与无颈部淋巴结转移的标本比较也存在明显的差异(p<0.01)。而在病理分期的因素中,所有的促血管生成因子及受体的表达均无差异。结论:1、在切取的NPC标本中,血管的分布有一定的规律,癌组织中无坏死部位的血管较为丰富,且分布较为混乱,在肿瘤组织边缘同样血管生成较为活跃。2、内皮细胞特异性的信号传导通路,VEGF/KDR和Angiopoietins/Tie2在NPC组织中明显的活化,推测共同参与肿瘤血管的生成,两者缺一不可。3、上述两条信号传导通路的活化是不协调的,从而导致肿瘤血管在结构和功能上存在明显的缺陷,更有利于肿瘤细胞的生长。4、VEGF、Ang2和Tie2表达上调可能与肿瘤的浸润性及转移有关。第二部分EGCG抑制肿瘤血管生成的实验研究目的:肿瘤在其生长过程中可分泌大量的促血管生成因子,但目前发现的特异性作用于内皮细胞的因子包括Vascular endothelial growth factor (VEGF)、Angiopoietins和Ephrin家族,他们与内皮细胞上的受体结合而产生促血管生成的作用。VEGF在血管生成方面起着重要的作用,可以增加血管通透性和内皮细胞增生;刺激体外培养的内皮细胞迁移;对内皮细胞具有抗凋亡作用。目前的研究证实,这些生物效应主要是通过VEGF受体KDR/Flk-1信号传导实现的。血管内皮细胞膜上的另一酪氨酸激酶受体Tie2参与新生血管的形成并维持血管结构的稳定,从而保证新生血管可以发挥正常的生理功能。其配体血管生成素(Angiopoietin)的结合使得Tie2磷酸化,并且导致其下游的信号传导途径的活化。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin 3-O-gallate,EGCG)是茶叶中最重要的成分,具有很多的生物学效应,在许多的实验研究中已经得到证实,诸如防癌抗癌、抗氧化作用、消炎及调节免疫作用。在防癌抗癌的作用中,其主要的机理是激活不同的信号传导途径诱导肿瘤细胞的凋亡,抑制某些酶的活性。近十几年,EGCG抑制肿瘤血管生成的研究已经引起许多的学者的重视,因此,本实验的主要目的是观察EGCG对人NPC细胞株HNE-1和人内皮细胞株ECV304增殖的影响,以及对受体酪氨酸激酶磷酸化的抑制作用,揭示EGCG抗肿瘤生长及血管生成的分子机制。方法:1、MTT:将融合的培养细胞HNE-1和ECV304用胰酶消化,吹打散计数并调整细胞数目为1×105,取96孔板,每孔加入细胞混悬液100ul,同时给于不同的处理,设置三个复孔,对照孔加入常规培养液。EGCG浓度分别为25uM、50 uM、75 uM、100 uM。培养48小时后分别加入MTT(10mg/ml)20ul,继续培养4小时,加入二甲基亚枫(DMSO)100ul,室温放置15分钟,酶标仪上检测570nm波长的吸光度(OD值)。2、体外内皮细胞血管样结构培养试验: 4体积鼠尾型胶原2.5mg/ml,1体积混合液(10×DMEM培养液:0.34N Na2CO3=2:1,1N NaOH调节pH至7.3)。取96孔板一块,每孔加入上述培养液100ul, 37℃5分钟凝固。调整ECV304细胞数目至1×105,每孔加入100ul,37℃、5%CO2条件下培养24小时,PBS洗涤细胞两次,加入处理条件不同的培养基。VEGF浓度50ng/ml,HNE-1条件培养基(HNE-1 Conditional Medium, HNE-1 CM)50ul,EGCG浓度分别为25uM、50 uM、75 uM、100 uM。每天观察细胞生长情况,每两天照相一次,共培养8天。3、RT-PCR: ECV304接种于6孔板,每孔加入细胞,培养至细胞铺满整个培养孔,弃取上清,PBS洗涤两次,分别加入含有EGCG不同浓度的DMEM培养液,EGCG浓度分别为25uM、50 uM,37℃、5%CO2条件下培养24小时后,分别加入VEGF 50ng/ml和HNE-1 CM 500ul,继续培养5分钟,弃上清,PBS洗涤细胞两次,含0.02%EDTA的胰酶消化并收集细胞。RT-PCR按照Invitrogen公司One-step RT-PCR试剂盒操作手册进行操作。4、免疫沉淀:细胞培养及收集同3,各加细胞裂解液100ul,充分裂解。取200ug蛋白,加入抗体KDR或Tie2(浓度2ug/ml),4℃过夜,免疫沉淀分离抗原按Pierce公司免疫沉淀试剂盒操作手册进行。将含有抗原蛋白洗的脱液体进行低温抽干至剩余40ul时,加入5×上样缓冲液20ul(每20ul加5ul),煮沸5分钟即可。8%SDS-PAGE胶进行蛋白电泳分离后,硝酸银染色。5、Western blot:将上述蛋白进行电泳分离后,转移至硝酸纤维素膜上,5%脱脂奶粉封闭1小时,加入泛磷酸化抗体p-Tyr (PY99) 1:1000,4℃过夜,TBST洗膜后,加入HRP标记的鼠二抗振荡后,洗膜同前,ECL显影。6、动物实验:将培养的融合HNE-1细胞胰酶消化并计数,于2只裸鼠右胁部皮下注入1×106个细胞,待种植的NPC生长至5×5mm2时,处死动物,取出肿瘤并将肿瘤切割成约1mm3的小块,分别种植到实验组裸鼠左胁部皮下,待肿瘤生长到5×5mm2时开始实验。实验裸鼠共21只,随机分为3组:对照组(7只)、高剂量组(7只,EGCG剂量为50mg/kg)和低剂量组(7只,EGCG剂量为10mg/kg)。EGCG经腹腔注射,隔日给药一次,对照组腹腔注射等体积的生理盐水。隔日称重,游标卡尺测量瘤体的长径及短径,按公式:肿瘤体积=1/2短径2×长径,计算出肿瘤体积。采用免疫组织化学的方法检测肿瘤中血管内皮细胞特异分子CD34,具体方法见第一部分。7、统计学处理:所有计量数据均以平均值±标准差( x±s)表示。两个样本均数比较采用Student’s test;多组均数比较采用One-ANOVA检验。P<0.05表示存在差异,p<0.01表示存在明显差异。结果:1、EGCG对内皮细胞ECV304及NPC细胞HNE-1增值的影响:EGCG可明显抑制NPC细胞HNE-1的增殖,抑制率为,与对照组比较存在明显的差异(p<0.01)。而在内皮细胞的抑制实验中,EGCG未出现明显的细胞增殖抑制现象。2、EGCG对内皮细胞受体KDR和Tie2基因转录水平的影响:采用RT-PCR的方法检测内皮细胞膜上KDR和Tie2受体基因转录水平,发现在对照组中,内皮细胞酪氨酸受体KDR和Tie2有表达,VEGF或HNE-1CM均能明显刺激两个受体的基因转录水平上调;而预先EGCG处理后,内皮细胞膜上的两个受体表达出现下调,并且观察到两个受体mRNA的下调随剂量变化明显。3、EGCG抑制内皮细胞受体KDR和Tie2磷酸化的作用:在无外界刺激的情况下,内皮细胞存在KDR和Tie2受体的蛋白合成,但在重组VEGF或HNE-1 CM的刺激下,两个受体的蛋白合成及磷酸化水平明显增强。如果先用含有EGCG的培养基处理内皮细胞,再给予VEGF或HNE-1 CM刺激,则KDR和Tie2受体的蛋白合成及磷酸化水平明显受到抑制,并且也是剂量依赖性的。4、EGCG对体外血管生成抑制作用:在含有胶原成分的培养基,将内皮细胞ECV304接种其上,在不同方法作用下,不同时间内观察到内皮细胞形成的管状结构。结果显示,对照组中内皮细胞形成的管状结构较为完整清晰,形态可维持约4天;VEGF或HNE-1 CM均可刺激内皮细胞形成管状结构,并且细胞增生也明显,在第8天仍可观察到培养基中的管状结构。与对照组比较,在预先用EGCG处理的内皮细胞组中,形成的管状结构数目较少且短,而此时再用VEGF和HNE-1 CM刺激,所形成的管状结构也显示出不规则,甚至出现一些内皮细胞堆积现象,在HNE-1 CM处理组中可见部分细胞死亡。随着EGCG作用的时间延长,所形成的管状结构出现明显的退缩。在高剂量EGCG(50uM)的作用下,内皮细胞形成的管状结构显著减少,并且长度也明显缩短。5、EGCG体内抑制肿瘤生长及血管形成作用:建立起NPC裸鼠模型后,给于不同浓度的EGCG腹腔内注射进行试验性治疗。结果发现,对照组中,种植瘤随时间的延长,肿瘤体积明显增大。而EGCG高剂量组(50mg/kg)中,裸鼠肿瘤生长受到明显的抑制,而且EGCG剂量越大,肿瘤的抑制效应也越明显(p<0.05),在22天时,与对照组比较,高剂量组肿瘤抑制率达39.8±5.1%。低剂量组(10mg/kg)中种植瘤体积减小不明显。在22天处死的动物解剖中三组均未见两肺及腹腔肿瘤的转移,在高剂量组中,有2只裸鼠出现肿瘤局部坏死。肿瘤组织的病理学检查也发现,在高剂量组中, 3只存在坏死灶(3/7),而低剂量组中仅1只(1/7);对照组中未发现肿瘤坏死的情况。肿瘤中CD34免疫组织化学证实,对照组中,肿瘤组织中存在丰富的新生血管;而在低剂量EGCG和高剂量EGCG组中血管的生成较少,尤其在肿瘤坏死的区域。另外,三组裸鼠的体重在试验阶段无明显差异存在。结论:1、EGCG可以明显的抑制NPC细胞HNE-1的生长,而对内皮细胞ECV304的影响较小。2、EGCG在基因转录水平抑制内皮细胞受体KDR和Tie2的表达,导致其蛋白合成下降,并且降低他们的磷酸化水平。3、在离体的血管形成实验中,EGCG可抑制内皮细胞ECV304血管网状结构的形成。在裸鼠NPC模型中,EGCG在较高剂量(50mg/kg)时可显著的抑制肿瘤的生长及血管的生成,并且对机体的生长影响较小。4、本实验证实,EGCG具有抑制NPC细胞HNE-1生长的作用,又可以抑制肿瘤血管的形成。是一个具有很大潜力的抗肿瘤药物。