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研究背景:食管癌是指由食管腺上皮或鳞状上皮的异常增生所形成的恶性病变。它是最常见的恶性肿瘤之一,且其发病率存在明显地域差别,中国是高发地区之一。化疗是治疗晚期食管癌患者的重要手段,但是目前的化疗药会出现一些弊端如不良反应多、易产生耐药性从而导致化疗失败。为了应对这种不利局面,新的化疗药物的开发和肿瘤分子机制的研究就显得尤为重要。Bcl-2家族蛋白主要通过干扰线粒体膜的完整性来调控细胞凋亡。Bcl-2和Bcl-xl蛋白的高表达与食管癌发生发展密切相关。Bcl-2基因的异常扩增导致食管癌细胞增殖异常,而Bcl-2和Bcl-xl蛋白异常表达与肿瘤细胞对化疗药物的耐受性有关。Bcl-2的表达量还是鉴别食管癌细胞分化程度的一个重要指标,同时它也影响食管癌的预后。因此,在食管癌治疗上,Bcl-2家族蛋白是一个很有吸引力的靶点。本课题选用的AT-101来源于天然产物棉酚,是通过Bcl-2位点筛选出来的Bcl-2抑制剂。AT-101是醋酸棉酚的R-(-)的对映体,跟棉酚相比毒副作用更小。由于它最初是作为口服的抗生育药使用,因此我们可以借鉴其天然产物安全性的数据。AT-101可以同时抑制Bcl-2、Bcl-xl和Mcl-1这三个靶点。在体内外实验中,AT-101均可以抑制恶性肿瘤增殖和诱导细胞凋亡。虽然AT-101能抑制肿瘤细胞增殖,且其治疗实体瘤已进入二期临床阶段,但是AT-101对食管癌细胞的抗肿瘤作用并不清楚。此外,鉴于目前有很多药物可以通过改变细胞周期从而发挥其抗肿瘤作用。因此,在本研究中我们探讨了 AT-101能否抑制人食管癌细胞活力.,并进一步探究了其抑制人食管癌细胞活力的机制。接下来,我们还探究了 AT-101诱导人食管癌细胞周期阻滞和凋亡的作用机理。我们希望本研究能为AT-101临床应用于食管癌的治疗提供实验依据。研究目的:本课题的研究目的是检测AT-101对人食管癌细胞周期和凋亡的影响,并进一步探究其诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡的机制,为临床应用AT-101治疗食管癌提供实验依据。研究方法及结果:本课题首先采用MTT法检测AT-101对人食管癌细胞活力的影响,发现AT-101能显著抑制人食管癌细胞的活力。然后通过流式细胞术检测细胞周期和凋亡,发现AT-101能诱导人食管癌细胞发生G1/Go期周期阻滞和凋亡。通过荧光定量PCR方法,检测到AT-101上调食管癌细胞的p53和p21wafl/Cip1基因表达量;通过 western blot,我们发现 AT-101 增加了 p-p53(Ser 15)、p53 和 p21wafl/Cip1蛋白表达,但是不改变p27、CDK2/4/6和Rb蛋白的表达,同时AT-101减少了cyclinD1、p-Rb(Ser780)和E2F-1蛋白的表达。进一步研究发现AT-101显著降低了人食管癌细胞β-catenin蛋白的表达。通过小分子激活剂和抑制剂调控β-catenin表达,我们发现β-catenin激活剂WAY-262611能够削弱AT-101诱导的G1/Go周期阻滞并削弱AT-101对细胞β-catenin和cyclin D1蛋白表达的下调;β-catenin抑制剂XAV-939能够促进AT-101诱导的G1/G0周期阻滞并促进AT-101对人食管癌细胞cyclin D1蛋白表达的下调。最后,用western blot方法检测凋亡相关蛋白,我们发现AT-101能抑制Bcl-2和Mcl-1蛋白,进而激活cytochrome C/caspase-9/caspase-3/PARP 通路,诱导细胞凋亡。研究结论:1.AT-101显著性抑制人食管癌细胞株EC109和CaES-17细胞活力,其IC50值为 2-3μM。2.AT-101诱导EC109和CaES-17细胞发生G1/Go周期阻滞和细胞凋亡。3.AT-101通过抑制β-catenin/cyclin D1通路诱导人食管癌细胞G1/G0周期阻滞。4.AT-101促进p53/p21waf1/Cip1的基因转录和蛋白表达,并通过减少p-Rb和E2F-1蛋白诱导人食管癌细胞G1/Go周期阻滞。5.AT-101能抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。Bcl-2蛋白被抑制之后,其下游cytochrome C/caspase-9/caspase-3/PARP 被活化,诱导细胞凋亡。