细胞外信号调节激酶5信号转导通路在实验性氟中毒神经损害机制中的作用

来源 :贵州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:leezero555
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目的:检测慢性氟中毒大鼠脑组织及体外培养神经细中胞细胞外信号调节激酶5(extracellular-signa1regulated kinase5, ERK5)蛋白及mRNA水平的表达,分析其表达改变与大鼠学习记忆能力改变的关系,深入探讨慢性氟中毒神经系统损害的发病机制。  方法:取2月龄SD大鼠30只,体重120-150g,按体质量采用随机数字表法分为3组,每组10只,雌雄各半。对照组:自由饮用自来水(含氟量<0.5 mg/L);低氟组:饮水中加氟(NaF配制),使其含氟量为10.0 mg/L;高氟组:饮水含氟量为50.0 mg/L。各组大鼠饲以标准动物饲料,氟含量<0.5 mg/kg;实验期为6个月。用SH-SY5Y细胞进行体外培养,加入不同剂量氟化钠(0.0-1.0 mmol/L)进行处理。实验结束时,观察染氟大鼠氟斑牙情况;收集大鼠24小时尿量,用氟离子电极法测量大鼠尿氟含量;用HE染色方法观察大鼠皮质及海马区的组织病理学改变。用免疫组化方法检测大鼠脑组织不同区域中神经细胞磷酸化的ERK5(P-ERK5)及ERK5总蛋白的表达;用免疫蛋白印迹法(Western blotting)检测大鼠脑组织中P-ERK5及总ERK5的蛋白表达;采用Morris水迷宫方法测定慢性氟中毒大鼠学习记忆能力。采用CCK8实验方法检测氟对培养细胞的毒性;用Western blotting检测体外培养神经细胞中P-ERK5和总ERK5的蛋白表达;用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测培养细胞中mRNA表达。  结果:染氟组大鼠出现不同程度的氟斑牙,大鼠尿氟含量随着染氟剂量的升高而逐渐升高(F=120.381,P<0.05);染氟组大鼠未见明显的病理学变化,仅高氟组大鼠海马CA3、CA4区神经细胞分布稍紊乱;对照组、低氟组、高氟组大鼠脑组织经免疫组化测定的P-ERK5蛋白表达水平(平均OD)相比较,高氟组在皮质区较其它组明显升高(F=7.249,P<0.05),海马CA3区染氟组较对照组升高(F=14.631,P<0.05),海马CA4区随着染氟剂量的升高而逐渐升高(F=42.527,P<0.05)。各组动物脑组织染氟组ERK5总蛋白水平相比较,高氟组在皮质区、海马CA3区、海马CA4区均较其它组明显升高(F=6.152、F=24.123、F=15.705,P<0.05)。对照组、低氟组、高氟组大鼠脑组织经Western blotting测定的P-ERK5蛋白表达水平相比较,随着染氟剂量的升高而逐渐升高(F=11.364,P<0.05);各组ERK5总蛋白水平在高氟组较正常组升高(F=2.791,P<0.05)。水迷宫测定中定向航行实验第2、3、4天,染氟组大鼠逃避潜伏期逐渐延长(H=28.20、29.90、26.47,P<0.05),穿越平台次数逐渐减少(H=27.23、35.344、27.62,P<0.05)。第5天空间探索实验,实验组大鼠第1次穿越平台时间逐渐延长(H=31.41,P<0.05)、穿越平台次数逐渐减少(H=30.80,P<0.05)。大鼠脑组织P-ERK5蛋白表达水平与大鼠第5天穿越平台次数呈负相关关系(r=-0.409,P<0.05),而与大鼠第5天第一次穿越平台时间呈正相关关系(r=0.718,P<0.01)。当染氟处理细胞后,0.5、1.0mmol/L氟化钠处理组中SH-SY5Y细胞24小时存活率分别为0.89±0.03、0.57±0.06,48小时存活率分别为0.75±0.06、0.52±0.04,均低于对照组(1.02±0.02,P<0.05;1.05±0.02,P<0.05)。通过细胞毒性试验筛选出低氟组(0.5 mmol/L氟化钠)和高氟组(1.0mmol/L氟化钠)。染氟24小时后,高氟组 P-E R K5表达水平较其它组升高(F=6.237,P<0.05),E R K5总蛋白水平在高氟组较其它组升高( F=14.731,P<0.05)。染氟48小时后,染氟组 P-E R K5蛋白表达逐渐升高( F=46.913,P<0.05),而E R K5总蛋白在染氟组较对照组亦明显升高( F=17.877, P<0.05)。ERK5的 mRNA表达水平在任意组比较均无统计学意义(F=1.114, P>0.05)。  结论:慢性氟中毒大鼠脑组织及染氟神经细胞中磷酸化ERK5和总ERK5蛋白表达水平明显增加,与染氟时间和染氟剂量的增加有显著相关性,与学习记忆能力的降低有相关性;ERK5信号通路可能参与了慢性氟中毒神经损伤的过程,其表达水平升高可能对抗氟的神经毒性作用。
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