【摘 要】
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细胞色素P450是一类包含铁血红素,能够催化多种氧化反应的单加氧酶系。因其能在惰性碳氢键之间插入氧而被广泛被研究。此外它还能催化杂原子N,S等的氧化反应,脱烷基化和脱卤化等反应。尽管催化的反应多样,P450却存在催化活性较低,稳定性较差等问题。复杂的还原蛋白和还原酶体系对供受体之间的识别和电子传递的研究提出了难题。来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的 CYP102A1(P
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细胞色素P450是一类包含铁血红素,能够催化多种氧化反应的单加氧酶系。因其能在惰性碳氢键之间插入氧而被广泛被研究。此外它还能催化杂原子N,S等的氧化反应,脱烷基化和脱卤化等反应。尽管催化的反应多样,P450却存在催化活性较低,稳定性较差等问题。复杂的还原蛋白和还原酶体系对供受体之间的识别和电子传递的研究提出了难题。来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的 CYP102A1(P450-BM3)是一种P450蛋白,其还原酶与氧化区域通过柔性的Linker连接。与其他种类P450相比其具有独特优势:较强的羟基化能力,较高的可塑性以及较好的可溶性表达。然而底物特异性限制了 BM3的应用。对BM3进行理性设计和随机突变等工程化改造为获得底物谱更宽、催化能力更强的单加氧酶提供了强有力的方法。本文主要针对BM3突变体M13的催化反应进行研究,除了对M13的底物谱的宽泛性进行探索外,还通过对M13进行理性改造从而提高其对染料木素的催化能力。1.M13的底物宽泛性研究本研究将分子对接技术用于突变体M13的宽泛性研究,建立了一种计算机辅助的快速研究底物宽泛性的方法,与传统的方法相比省时省力,节约成本。实验结果表明当构象在距离和能量上满足一定标准后,反应即可发生。以此标准对不同类型的底物进行了分析和体外实验验证,实验表明预测结果与实验情况完全吻合。此外在宽泛性实验中发现M13不仅能催化药用分子奎宁、辛可宁、蟾毒灵和氢化可的松发生单羟基化反应,还能催化雄烯二酮,黄体酮发生双羟基化反应。实验结果表明M13具有较强的羟基化能力,能够催化较少见的甾体双羟基化反应。这为生物转化提供了强有力的元器件。2.M13突变改造提高其对染料木素的催化能力本研究在对M13结构进行理性分析的基础上,对86位异亮氨酸进行饱和突变,筛选获得突变体M13I86C,其催化染料木素的转化率较M13提高了近4倍;进一步运用计算机虚拟突变获得突变体M13I86C/P18W,其催化染料木素的转化率较M1I86C提高了近1.6倍。体外实验结果显示,M13的双突变体M13I86C/P18W催化染料木素的转化率较M13提高了近6-7倍。另外我们采用组合突变丙氨酸扫描实验发现了影响M13催化染料木素的关键氨基酸组合F390/P392和F390/K391。上述结果为M13的进一步突变改造奠定了基础。
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