论文部分内容阅读
猪流行性腹泻是猪的一种急性肠道接触性传染病,其主要以引发猪的呕吐、严重腹泻和脱水为主要临床特征。病毒和细菌等微生物的感染、饲养不当等都会导致猪的腹泻,但病毒感染是一个主要因素。其中猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus,RV)、猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)等是引起腹泻的常见病毒。考虑到这四种病毒在猪场的传播途径和引发的临床症状极为相似,在临床症状、病理解剖上难以辨别,需要借助实验室的一些检测手段加以诊断鉴别。最近越来越多的研究表明,这四种病毒在临床上常呈混合感染,为疾病的鉴别诊断带来巨大的挑战。很显然单重检测技术已不能满足临床大批量检测的需求,而多重RT-PCR技术能够在一个反应体系中同时检测多个临床样品,短时间内高效率鉴别检测几种病原,特别适合混合感染样品中多个病原的鉴别检测,综上考虑本研究建立了可同时检测和区分这四种病毒的四重RT-PCR检测技术,并初步用于临床样本检测。本研究针对近年来山东省四种病毒的主要流行株保守序列分别设计特异性引物,成功建立了能同时检测PEDV、RV、TGEV和PDCoV的多重RT-PCR方法。灵敏度实验数据表明本研究建立的多重PCR体系能扩增出PEDV、PDCoV、TGEV和RV的最低模板量分别为5、50、5和5拷贝,并且对猪常见的几种病原进行了PCR扩增,发现本方法特异性良好,可用于临床样品的检测。利用建立的四重PCR技术对2016-2018年收集的来自山东省德州、青岛及滨州等地临床样本进行了检测,临床发病猪肠道内容物、粪便及肛门拭子共计1212份。检测结果显示:PEDV的阳性率可达15.51%(188/1212),TGEV的阳性率是4.54%(55/1212),RV的阳性率为1.40%(17/1212),PDCoV检测阳性率是2.06%(25/1212);而PEDV与TGEV、PEDV与RV、TGEV与RV以及TGEV与PDCoV双重混合感染阳性率分别为3.63%、1.24%、1.07%和1.65%;PEDV、TEGV与RV,PEDV、TEGV与PDCoV以及PEDV、PDCoV与RV三重感染阳性率分别为1.65%、1.82%和0.83%。从检测结果可以看出居于首位的是PEDV占24.68%,其次是TGEV为14.36%,RV和PDCoV检出率较低,分别为7.18%和6.36%,总的样本中发生混合感染的样本占比为11.89%,但未出现四种病毒同时混合感染的情况。本研究为了解目前山东省部分地区PEDV的流行毒株与疫苗毒株S基因的具体差异情况,从2016年-2018年检测的阳性病料中随机选取不同地市的代表毒株8株,用设计的针对结构基因S的特异性引物进行RT-PCR扩增、克隆和测序,并对序列变化和遗传进化情况等进行分析。结果显示:其中7株样品株的S基因和国内疫苗株CV777相比,存在12个核苷酸的插入和3个核苷酸的缺失,而SDJN171115株在3592-3594之间还存在3个核苷酸的缺失;鉴定的8株毒株在S基因的主要突变区S1区的中和表位区有8处氨基酸的突变。同源性比对发现,8株山东省部分地区毒株之间的核苷酸同源性是93.7%-99.9%,与参考毒株的核苷酸同源性是93.1%-98.9%。遗传进化分析发现,所鉴定的毒株分处两个不同的群中,其中的5株样品株和主要的疫苗株的亲缘关系较远,但仍和中国近几年的流行毒株亲缘关系较近。研究结果表明近几年山东省部分地区PEDV与中国主要疫苗株相比仍然呈现较大变异,可能需要研制更有效的疫苗用于PED的防控。