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旋毛虫病(Trichinosis)是由毛尾目,毛形科的旋毛形线虫(Trichinella spiralis)引起的人畜共患病,严重危害畜牧业发展和人类健康。目前旋毛虫病的治疗仅依靠服用化学药物来达到效果,这对宿主机体的损伤非常严重。随着现代生物学技术的发展,利用基因工程技术研制的活载体疫苗作为新型疫苗之一,具有免疫方式简单、免疫原性强和成本低等优点,为旋毛虫新型疫苗研制提供了新思路。减毒沙门氏菌(attenuated Salmonella vector,RASV)作为载体的优点在于其本身有较强的侵入性,但又没有沙门氏菌的毒性,从而作为活载体疫苗具有应用价值。本试验通过旋毛虫43kuES抗原基因与减毒沙门氏菌载体pYA3681构建重组质粒pYA3681-Ts43,电转入减毒沙门氏菌χ11802中,经双酶切验证和质粒测序鉴定成功后,IPTG诱导减毒沙门菌进行目的蛋白表达,最后经动物实验评价重组减毒沙门氏菌的免疫效果。具体研究内容和实验结果如下:(1)旋毛虫ES抗原43ku基因重组减毒沙门氏菌构建将感染旋毛虫40天后的BALB/c小鼠断颈处死,采集肌肉,用胃蛋白酶消化肌肉,收集旋毛虫,于液氮中用研钵处理后提取旋毛虫总RNA,用反转录体系将RNA反转录为cDNA,根据GenBank上旋毛虫43kuES抗原基因序列信息,采用Primer5.0设计含有KpnⅠ和SacⅡ酶切位点的上下游引物,利用PCR扩增旋毛虫43kuES抗原基因,扩增产物经凝胶电泳鉴定,回收目的基因。-20℃保存备用。将回收的旋毛虫目的基因Ts43与减毒沙门氏菌载体pYA3681连接过夜,电转入大肠杆菌感受肽χ6212,经双酶切鉴定后电转入减毒沙门氏菌χ11802中,再次进行双酶切鉴定和序列测定。最后IPTG诱导进行目的蛋白表达,Western Blottig结果表明重组减毒沙门氏菌表达Ts43具有反应原性,可以对其免疫效果进行评价。(2)重组减毒沙门氏菌pYA3681-Ts43的免疫保护效果每组10只4-5周龄的BALB/c小鼠,将小鼠随机分为4组:空白对照组、PBS对照组、减毒沙门氏菌空载体组(pYA3681)、重组减毒沙门氏菌组(p YA3681-Ts43)。空白对照组正常喂食,不免疫;PBS组每次每只口服免疫200μLPBS溶液;pYA3681组每次每只口服免疫200μL空载体减毒沙门氏菌;pYA3681-Ts43组每次每只口服免疫200μL重组减毒沙门氏菌。每周免疫1次,每次免疫相隔7天,连续免疫3周,在第3次免疫过后7天,断颈处死5只小鼠,取血和肠道灌洗液,ELISA方法检测IgG、IgA、IL-4、IL-17a和IFN-γ水平。取脾脏和肠系膜淋巴结分离单细胞,流式细胞术检测小鼠CD4+T细胞及其胞内IL-4、IL-17a和IFN-γ细胞因子水平。第3次免疫后7天,将剩余的小鼠每只攻旋毛虫300条,攻旋毛虫后记录小鼠15天体重,计算体重丢失率。攻虫第42天处死小鼠检测肌肉中旋毛虫数量,计算减虫率,并取小鼠舌肌,做病理切片,观察病理损伤情况。实验结果表明:重组的减毒沙门氏菌可以有效的刺激脾脏和肠系膜淋巴结的增殖,通过ELISA方法检测的IgG、IgA、IL-4、IL-17a和IFN-γ水平明显升高,流式细胞术检测小鼠CD4+T细胞及其胞内IL-4、IL-17a和IFN-γ细胞因子水平也明显升高。通过小鼠的病理切片和减虫率可以发现,PBS组和空载体组小鼠肌肉内旋毛虫数量没有太大的变化情况,而重组菌组小鼠体内的旋毛虫数量明显减少。通过本试验可以发现,免疫过重组减毒沙门氏菌的小鼠对旋毛虫侵入机体有一定的抑制作用。这为制备旋毛虫病减毒沙门氏菌活载体疫苗研究奠定了基础,为该病免疫防治提供了新思路。