宇佐美曲霉产菊粉酶及其酶学特性研究

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燃料乙醇已成为当今研究的热点,但目前燃料乙醇无法与汽油竞争,主要是价格过高,降低成本是研究燃料乙醇的关键。菊芋的主要成分是菊粉,在菊粉酶的作用下水解为果糖,是微生物发酵生产乙醇的良好糖源。菊芋易种植,利用菊芋为原料发酵生产乙醇,可以降低发酵生产乙醇的成本。由于微生物菊粉酶在发酵生产乙醇中起到很重要的作用,因此筛选高产菌株、提高水解菊粉酶的酶活力有着非常重要的意义。从本实验室保存的五株能产菊粉酶的菌种中进行筛选,选取了产酶活力最高的宇佐美曲霉进行了进一步的研究。论文的主要研究结果如下:1.采用单因素试验、Plackett-Burman设计和响应面法优化了培养基组成。单因素试验结果表明,菊芋汁、蛋白胨和(NH42HPO4是影响宇佐美曲霉产菊粉酶的主要因素;响应面分析进一步优化的菊芋汁、蛋白胨和(NH42HPO4的最适浓度分别为117.28 g/L、22.14 g/L、3.94g/L。研究结果表明,优化的菊粉酶液体发酵培养基组成为:蛋白胨22.14g/L、菊芋汁117.28g/L、(NH42HPO4 3.94 g/L、NaCl 5.0g/L、MgSO4 0.50g/L、MnSO4 0.10g/L;发酵的最佳pH值为6.5、发酵温度为28℃、装液量为50mL/300mL。2.对菊粉酶初提液的基本酶学性质进行了研究。该酶最适温度为60℃,最适pH值为6.0;该酶40-60℃保温1h能保持80%的酶活力,在pH值3.0~7.0的范围内常温放置1h能保持80%以上的酶活力;菊粉酶的米氏常数为:Km=83.77mg/mL,最大反应速度为:Vmax=5.52mg/mL·min。同时也研究了浓度均为1.0 mmol/L的不同种金属离子对菊粉酶酶活力的影响。结果表明,Na+和Mn2+对菊粉酶的酶活力有一定的激活作用;Cu2+对菊粉酶的酶活力基本没影响;Fe2+和Mg2+对菊粉酶的酶活力有一定的抑制作用。3.将菊粉酶初提液进行纯化,先通过(NH42SO4分级沉淀、DEAE-Cellulose离子交换色谱、SephadexG-100凝胶过滤色谱等分离纯化后,采用SDS-PAGE分析,结果显示有五个蛋白区带。其中第一条蛋白区带不具有酶活性,可能是杂蛋白;其余四个蛋白区带均具有酶活性,提示菊粉酶可能为一组同工酶。4.对宇佐美曲霉发酵菊芋进行了研究。通过单因素试验和正交试验,得出宇佐美曲霉发酵菊芋产还原糖的优化培养基组成为:110%菊芋汁、0.3%KH2PO4、0.4%MgSO4
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