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Reteplase(瑞替普酶)是临床上常用的治疗血栓性疾病的第三代溶栓药物,探索和研究新型、高效的表达系统对Reteplase的临床应用意义重大。实验室前期尝试利用烟草花叶病毒(Tbobacco Mosaic Virus,TMV)载体表达系统在本氏烟(N.benthaminana)叶片内质网中表达重组Reteplase,出现了重组Reteplase表达后接种叶片细胞坏死的现象,产生的原因尚不明确。考虑到这一现象具有一定的普遍性,细胞坏死对于表达产物的定量和下游纯化等环节有一定程度的影响,而且接种后的坏死理论上会影响表达产物在细胞内的积累,因而剖析现象产生的主要因素对于合理使用植物病毒载体表达系统具有一定的现实意义。基于此,我们从坏死症状产生的主要因素分析、改善坏死症状的措施探究和利用保护性标签(Zera)表达重组Reteplase等三个方面开展了相关研究。为了探索坏死症状产生的主要因素,在其它实验条件保持一致的情况下,从更换外源基因和更换病毒表达载体等两方面入手开展研究。首先,在pTMVrPA-NSK病毒表达载体的基础上替换Reteplase编码基因,构建了表达报告基因GFP的TMV病毒表达载体pTMV GFP-NSK。接种受体植物本氏烟后,对其表型和外源基因表达情况与pTMV rPA-NSK载体处理进行了比较分析。结果显示,pTMVGFP-NSK载体表达了报告基因GFP且在整个观察期内未产生坏死现象。初步证实,坏死症状的产生不是由TMV病毒载体本身独自造成的。其次,将TMV病毒表达载体替换为CPMV病毒载体,构建了 CPMV rPA-NSK载体。结果显示,CPMV rPA-NSK病毒表达载体可以表达重组Reteplase且没有造成坏死症状。虽然,TMV病毒载体的表达量略高于CPMV。但是,CPMV病毒载体在接种后第7 d和第9 d的表达量要高于TMV病毒载体接种后第5 d的表达量,而TMV病毒载体在接种后第5 d就产生了明显的坏死症状,CPMV病毒表达载体在接种后第9 d依然观察不到坏死的现象。因此,认为表达后出现的叶片坏死症状不是由重组Reteplase单独造成的。综合上述实验结果来看,是TMV病毒载体与重组Reteplase共同作用造成了坏死症状的出现。在明确造成表达后叶片坏死的主要因素的基础上,尝试从改变重组Reteplase细胞表达空间和更换受体植物两方面改善坏死症状。首先,以内质网表达的pTMVrPA-NSK病毒载体为基础,分别构建胞外、线粒体和叶绿体表达的TMV病毒表达载体。接种后的结果显示,胞外表达的病毒载体未出现坏死症状,但样品中也未检测到重组Reteplase的表达,线粒体表达的病毒载体出现严重坏死症状,仅检测到微量的表达;叶绿体表达的病毒载体未出现坏死,表达量低于内质网表达的重组Reteplase;内质网表达的病毒载体出现的坏死症状严重程度低于线粒体,重组Reteplase表达量最高。结果表明,细胞表达空间在Reteplase的表达效率和在细胞坏死表型及其程度上均存在差异。其次,分别将pTMV rPA-NSK病毒载体接种于N.benthamiana.excelsiana等两种受体植物上,检验受体植物对表达的影响。结果显示,N.benthamiana上的症状比N.excelsiana严重,而N.benthamiana中重组Reteplase的表达量略高于N.excelsiana。结果表明,不同受体植物在坏死表型程度上存在差异,认为N.excelsiana较适合作为表达重组Reteplase的TMV病毒载体受体植物。为了解决重组Reteplase的内部断裂的现象,开展了利用Zera保护性标签表达重组Reteplase的研究。结果表明,Zera标签蛋白质微粒的形成是一个从可溶到聚集的动态演变过程,聚集态不溶性蛋白质微粒对重组Reteplase的完整性具有一定程度的保护作用;而可溶形式的Zera-rPA重组产物依然会受到细胞蛋白酶的攻击,致使保护性标签的有效保护率下降。