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第一部分巨噬细胞向M1型极化中的糖原代谢变化及作用研究目的:本研究发现M1型巨噬细胞中糖原代谢增强,进而解释在M1型巨噬细胞的极化、功能及存活中糖原代谢的变化。并进一步研究了磷酸戊糖代谢途径与巨噬细胞向M1型极化的关系。方法:(1)使用小鼠骨髓来源的巨噬细胞诱导为M1型或M2型并使用电镜、PAS染色以及糖原检测试剂盒等检测胞内糖原含量,使用Real-time PCR的方法检测糖原代谢途径相关基因的表达;(2)使用葡萄糖检测试剂盒检测M0,M1及M2型巨噬细胞摄取葡萄糖的效率,使用Real-time PCR的方法检测巨噬细胞中葡萄糖转运蛋白,己糖激酶基因以及糖异生相关基因的表达;(3)以siRNA沉默Gys1以及Pygl的表达后,使用Real-time PCR的方法检测M1型巨噬细胞的表型与功能相关基因的表达,并使用GPI抑制糖原代谢途径的流通,使用Real-time PCR,ELISA以及NO检测试剂盒,检测M1型表型相关基因的表达,以及相关细胞因子的分泌和NO水平;(4)以siRNA沉默Gys1以及Pygl的表达,或以GPI处理巨噬细胞,使用LDH检测试剂盒检测对M1型巨噬细胞存活的影响；(5)使用ROS荧光探针检测GPI处理后M1型巨噬细胞胞内ROS水平;(6)使用Real-time PCR,NADPH和GSH检测试剂盒检测M0,M1或M2型巨噬细胞磷酸戊糖代谢途径的水平;(7)以GPI,6AN及OT抑制糖原代谢途径以及磷酸戊糖代谢途径后,使用NADPH、GSH及糖原检测试剂盒检测巨噬细胞内NADPH、GSH及糖原水平,并在GPI,6AN或OT处理细胞的同时加入GSH,使用试剂盒检测胞外LDH的水平;(8)以6AN或OT抑制磷酸戊糖代谢途径的流通,检测M1型巨噬细胞表型与功能相关基因的表达及分泌促炎细胞因子与NO的能力;(9)以NOX2抑制剂DPI处理巨噬细胞并检测其胞内ROS水平,并探究M1型巨噬细胞分泌促炎细胞因子及NO的能力;(10)GPI处理小鼠后,以LPS建立感染性休克小鼠模型,以conA建立小鼠肝炎模型,检测其血清中促炎细胞因子水平,以及小鼠生存率或肝脏损伤情况。结果:(1)与M0型及M2型巨噬细胞相比M1型巨噬细胞糖原含量更高,且糖原代谢途径增强;(2)M1型巨噬细胞是通过从胞外转运的大量葡萄糖而富集大量的糖原;(3)抑制糖原代谢途径会抑制M1型巨噬细胞的极化与功能;(4)siRNA或GPI抑制糖原代谢途径会使M1型巨噬细胞LDH释放增多;(5)抑制M1型巨噬细胞的糖原代谢途径会产生更多的ROS;(6)M1型巨噬细胞磷酸戊糖代谢途径水平增强;(7)外源GSH可以恢复GPI、6AN或OT对M1型巨噬细胞造成的损伤,(8)抑制磷酸戊糖代谢途径也会抑制M1型巨噬细胞的极化与功能,并影响巨噬细胞的存活;(9)DPI抑制M1型巨噬细胞ROS的产生,会抑制其极化与功能;(10)在LPS诱导的感染性休克小鼠以及conA诱导的肝炎小鼠模型中,抑制糖原代谢通路的流通,会降低小鼠血清中相关促炎细胞因子的水平。结论:巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞时从胞外吸收大量葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖,糖原富集且糖原代谢途径明显增强,糖原分解产生的6-磷酸葡萄糖可流向磷酸戊糖代谢途径,磷酸戊糖代谢途径可以提供大量的NADPH以产生GSH减轻细胞的氧化应激,维持细胞ROS在一定水平,可保证M1型巨噬细胞的极化、功能与存活。而过低的ROS也会影响M1型巨噬细胞极化与功能。M1型巨噬细胞极化时的这种代谢方式的转变,可能为治疗炎症提供一种新的方法。第二部分PCK1介导的糖原代谢调控CD8+记忆性T细胞形成和维持的研究目的:利用OT-I转基因小鼠和T细胞过继模型获得CD8+记忆性T细胞(CD8+Tm),通过研究CD8+Tm形成过程中糖异生代谢途径的改变,探索糖异生途径关键酶PCK的表达对CD8+Tm形成的影响,并研究糖原代谢途径对其形成及维持的影响,为寻找调节CD8+Tm形成的关键代谢靶点提供理论基础。方法:(1)从过继了 OT-ICD8+T细胞的小鼠体内流式分选得CD8+Tm,或体外用IL-15诱导获得记忆性T细胞,所得细胞使用Real-time PCR及Western blot的方法检测细胞内糖异生三个关键酶PCK1、FBPI和G6Pase的基因及蛋白水平表达;(2)用电镜及糖原检测试剂盒等检测体内外所得CD8+Tm内糖原含量,并用Real-time PCR的方法检测糖原代谢途径相关基因的表达;(3)以3-MPA抑制T细胞中PCK1酶活性,并利用PCK1敲除小鼠(PCK1+/A)体系,使用糖原检测试剂盒检测CD8+Tm中糖原的含量;(4)用OVA257-264再激活Lm-OVA诱导的Tm,同时以GPI处理,流式检测效应性相关标记;(5)将CD45.1 OT-I CD8+T细胞过继至WT小鼠并感染Lm-OVA,并腹腔注射GPI处理小鼠,在第6天或第30天时流式检测小鼠体内CD8+效应性T细胞(CD8+Teff)或CD8+Tm的数目;(6)并利用PCK1+/-小鼠体系,流式检测体内CD8+Tm的数目,研究抑制PCK1是否影响记忆性T细胞形成;(7)以GPI、6AN或3-MPA处理IL-15Tm后,使用NADPH及糖原检测试剂盒检测胞内NADPH及糖原水平；(8)以6AN、GPI、BSO或DNCB处理IL-15 Tm后,使用GSH检测试剂盒检测GSH/GSSH水平,使用ROS荧光探针检测ROS水平并使用流式计数;(9)将WT小鼠过继CD45.1 OT-I CD8+T细胞并感染Lm-OVA,30天后以3-MPA、GPI或6AN在有或无GSH时处理小鼠,流式检测体内Tm数目;(10)将WT小鼠过继CD45.1OT-ICD8+T细胞并感染Lm-OVA,同时3-MPA、GPI或生理盐水作为对照处理小鼠,30天时,皮下接种B16-OVA,观察小鼠皮下瘤生长大小及生存期,并利用PCK1+/-小鼠体系及过表达PCK1的CD8+Tm,检测与对照相比小鼠皮下瘤生长的大小。结果:(1)Tm与Tn及Teff相比,PCK1及FBP1的基因及蛋白水平显著上调表达,却不表达G6pase;(2)在CD8+Tm中糖原含量及糖原代谢相关基因表达均上调;(3)3-MPA抑制Tm中PCK1的酶活性使其胞内糖原含量下调,并且与野生型小鼠相比PCK1+/-小鼠体内产生的Tm糖原含量与下调;(4)GPI处理对Tm的再次激活程度并没有差异;(5)GPI抑制糖原代谢途径后对CD8+Teff的数目并没有影响,而CD8+Tm的数目下降;(6)PCK1+/-鼠Tm的形成数目与WT小鼠相比减少；(7)6AN、GPI以及3-MPA作用下的作用下,CD8+Tm胞内的总ROS水平显著上调,CD8+Tm形成的数目则大大减少;(8)抑制了 GSH系统后CD8+TmROS水平上调,CD8+Tm形成的数目也减少,而抑制了巯氧还蛋白系统后对胞内总ROS水平以及CD8+Tm形成的数目影响相对较少。(9)GSH处理后,小鼠体内Tm数目都比仅用抑制剂处理增多;(10)3-MPA和GPI处理组小鼠黑色素瘤的生长与对照组相比增大,小鼠的生存率下降,PCK1+/-小鼠组的小鼠皮下黑色素瘤生长与对照相比增大,而PCK高表达组的小鼠皮下黑色素瘤生长与对照相比明显受到抑制。结论:在CD8+Tm中明显上调糖异生酶PCK1及FBP1,生成大量的6-磷酸葡萄糖可流向糖原代谢途径,CD8+Tm糖原代谢增强,糖原分解后流向磷酸戊糖代谢途径,可产生大量的NADPH,以维持高水平的还原型谷胱甘肽水平,使其能清除过量的ROS,从而保证CD8+Tm的形成和长期维持。CD8+Tm形成和维持的这种分子机制可为寻找调节Tm生成的关键代谢靶点提供理论基础。