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水貂是世界上最重要的毛皮动物品种。水貂养殖广泛分布于北美、北欧、俄罗斯、阿根廷、乌克兰以及中国等国家。随着集约化、规模化程度的提高,在降低养殖成本的同时,高密度养殖也带来了细菌性疾病的蔓延传播,给水貂养殖业带来了巨大的经济损失。其中,由铜绿假单胞菌引起的出血性肺炎,死亡率较高,是水貂养殖过程中一种重要的细菌传染性疾病。噬菌体是感染细菌的病毒,是自然界分布最广的一种生物类群,具有存在广泛、研发时间短、成本低；增殖快；安全有效；无残留等优点,作为抗生素的替代品,具有广阔的研发前景。近年来,抗生素的过量使用以及超级细菌的出现,噬菌体作为抗菌制剂的研发又开始受到国内外专家的普遍关注,并相继有一些在食品加工过程中控制食源性致病菌的噬菌体制剂产品面市。本论文以水貂源铜绿假单胞菌为宿主,分离其裂解性噬菌体,研究应用噬菌体对水貂出血性肺炎的控制作用。具体实验内容与结果如下：1.采集出血性肺炎水貂的肺部样品,使用铜绿假单胞菌选择性培养基,分离得到5株铜绿假单胞菌疑似菌株,经生理生化指标及16S rDNA分子生物学鉴定,PA1-1、 PA5-1-1、 PA5-1-2、 PA5-2-1、 PA5-2-25株菌株分别均为铜绿假单胞菌,其16SrDNA序列已提交至GenBank数据库,登录号分别为KF977856、KF977857、KF977858、KF977859和KF977860；根据K-B法操纵规程和判断标准,分析铜绿假单胞菌分离株的耐药性,使用酶联免疫法检测外毒素A水平,结果显示,与2002年铜绿假单胞菌菌株相比,2012年分离得到的铜绿假单胞菌菌株对国内水貂养殖场普遍使用的庆大霉素和多粘菌素耐药性增强,外毒素A表达水平显著提高。2.采用丝裂霉素C诱导实验,证实铜绿假单胞菌菌株PA0205、 PA5-1-1为非溶源性细菌；以PA0205和PA5-1-1铜绿假单胞菌为宿主,采用双层平板法从医院废水中分离得到PPA0205和PPA-ABTNL2株噬菌体；透射电镜观察噬菌体的形态,表明PPA0205属长尾噬菌体科,PPA-ABTNL属短尾噬菌体科；宿主谱实验结果显示,噬菌体PPA-ABTNL可以裂解15株铜绿假单胞菌中的14株,而噬菌体PPA0205可以裂解15株铜绿假单胞菌中的2株,PPA-ABTNL宿主谱较宽；一步生长曲线测定结果显示,噬菌体PPA0205和PPA-ABTNL的潜伏期分别为30 min和25 min,裂解期分别为40 min和35 mmin,裂解量分别为70 PFU/infected cell和115 PFU/infected cell;pH(3-9)以及温度(-20℃-65℃)稳定性实验结果显示,与噬菌体PPA0205比较,噬菌体PPA-ABTNL稳定性较好,耐受pH和温度的变化；体外抑菌实验结果显示,PPA0205和PPA-ABTNL在6-7 h内能够控制各自宿主的增殖,而PPA-ABTNL抑菌效果较好。3.在氯化铯密度梯度介质中,采用超速离心的方法纯化噬菌体,提取噬菌体PPA-ABTNL的基因组,进行测序和生物信息学分析。结果表明PPA-ABTNL基因组大小为43227 bp,G+C含量为62.4%;共编码54个ORF；基因组可分为宿主反转区、DNA复制区和结构蛋白编码区,RNA聚合酶位于结构蛋白编码区前；比较基因组学显示,PPA-ABTNL与phiKMV属噬菌体phiKMV、 LKD16、LUZ19基因组结构上存在高度的相似性；系统发育树结果显示,PPA-ABTNL噬菌体DNA聚合酶、RNA聚合酶、衣壳蛋白编码基因与phiKMV属噬菌体具有同源性,且相似性较高；跨膜区分析结果显示,穿孔素蛋白氨基酸序列含有跨膜区,其中28-50氨基酸为跨膜的α-螺旋结构,跨膜区疏水氨基酸比例为69.6%；调控元件分析结果表明,基因组编码4个宿主启动子、3个噬菌体本身启动子和3个不依赖于ρ-因子的终止子。聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱分析证实,ORF38和ORF42分别编码衣壳蛋白和注射尾针蛋白,与生物信息学分析结果一致。以上结果表明,PPA-ABTNL属于phiKMV属,且不含有连接酶、转座酶及毒素蛋白编码基因,是裂解性噬菌体,可用于噬菌体治疗研究。4.连续3d采用滴鼻方式施用噬菌体粗制液20μL (1012PFU/mL-d),7d后取(BALB/c小鼠肺脏、肝脏HE染色,与生理盐水组相比较,噬菌体组小鼠肺脏、肝脏出现轻微炎症反应,但无异常行为表现。在动物实验初步证明噬菌体粗制液的安全性以及超声喷雾对噬菌体效价无显著影响的基础上,采用超声喷雾的方式,施用噬菌体治疗水貂出血性肺炎实验,具体方法为：实验组、对照组水貂鼻腔接种108PFU的铜绿假单胞菌,2h后在120cm×50cm×40cm的密闭容器内,使用超声喷雾器施用不同浓度的噬菌体3 min(流量为3ml/min),在噬菌体施用后,再额外持留3 min。24 h后检测水貂肺部的铜绿假单胞菌数量和噬菌体效价,结果显示,与对照组(n=8)相比,MOI=1、10、100噬菌体处理组(n=8)铜绿假单胞菌数量分别降低了5.08%(P>0.05)、19.42%(P<0.05)和26.13%(P<0.05),噬菌体效价分别为3.33 PFU/g (P>0.05)、 293.00 PFU/g (P<0.05)和13593.67 PFU/g (P<0.05)。在12d的实验期内,与对照组相比,MOI=1、10、100噬菌体处理组存活率分别为20%(P>0.05)、80%(P<0.05)和100%(P<0.05)。综合以上分析可见,在30 dm3/只水貂的空间内,采用超声喷雾的方式施用MOI=10的噬菌体PPA-ABTNL,可控制水貂的出血性肺炎。综上所述,本研究针对引起水貂出血性肺炎的铜绿假单胞菌分离得到了2株噬菌体,对其进行了生物特性研究,选择裂解量较大、宿主谱较宽的噬菌体PPA-ABTNL进行了生物信息学分析,结果显示PPA-ABTNL噬菌体为phiKMV属噬菌体,是裂解性噬菌体。采用超声喷雾的方式施用噬菌体PPA-ABTNL可控制水貂出血性肺炎,提高水貂存活率,为应用噬菌体控制水貂等动物肺部细菌性疾病奠定了基础。