“四时五脏阴阳”理论源于《黄帝内经》,是在“天人相应”的思想指导下形成的。该理论强调人体内在的脏腑生理机能,与外界自然时辰、季节之间存在着协调共振的适应性变化规律,成为从时间医学角度研究中医藏象实质的一个重要切入点。1研究目的通过对四时正常生理状态下褪黑素与下丘脑-垂体-性腺轴功能相关关系的实验研究,从褪黑素及性腺轴激素水平、褪黑素受体水平、褪黑素合成限速酶活性、细胞信号转导的不同层面观察四时变化对性腺轴功能的影响和作用的传导通路,以及褪黑素在这过程中对其所产生的季节相关性作用,从生理角度分析和研究机体内在功能的时间变化与外界自然时节所具有的同步性,为揭示“四时五脏阴阳”理论的科学内涵提供实验依据。2研究方法2.1文献整理采用文献学、逻辑分析等方法按时间顺序系统地梳理医学古籍中对四时变化与人体脏腑功能相关的记载,从生理变化、诊断、治疗、预防、保健等方面进行分析阐述,总结现代对四时因素影响人体脏腑功能研究的文献依据。2.2实验研究2.2.1研究思路从褪黑素与下丘脑-垂体-性腺轴的相关性切入,分别在一年内春分、夏至、秋分、冬至,检测血浆内褪黑素、性腺轴分泌激素,以及下丘脑、垂体、睾丸组织中的褪黑素、褪黑素受体和它们所分泌激素的含量,观察四时变化对性腺轴功能的影响；同时还分别检测下丘脑、垂体、睾丸组织中褪黑素AANAT、HIOMT活性的四时变化,从褪黑素合成限速酶的节律分析褪黑素对性腺轴季节性调控的具体物质功能变化规律；最后检测下丘脑、垂体、睾丸组织中第三信使c-fos和c-jun的四时表达强度,从细胞信号转导的角度探讨性腺轴功能应时变化的产生。2.2.2实验动物SPF级雄性叙利亚金黄地鼠,二月龄,120-140g／只。分别在春分、夏至、秋分、冬至前两周由北京维通利华动物研究中心购入,每季节分三组,每组8只,适应性饲养-周。饲养条件：自然光照,湿度50%-70%,室温冬季18±2℃,夏季25±2℃。饲料为北京维通利华实验动物中心提供的普通鼠全价颗粒饲料。分别在二分二至日晚上10点,于暗室内5w红光灯下取材。2.2.3检测方法血浆中MT、GnRH、FSH、LH、T与下丘脑、垂体、睾丸组织中MT、MR、GnRH、FSH、 LH、T、AANAT、HIOMT检测采用酶联免疫吸附试验法(ELISA);下丘脑、垂体、睾丸组织中c-fos mRNA 和 c-jun mRNA的表达使用原位杂交法(TISH)检测。2.2.4分析统计方法(1)原位杂交图像分析使用专业图像分析软件Image-Pro Plus;(2)各组数据均用均数±标准差(x±s)表示,运用SPSS 20.0统计软件分析,以P<0.05为差异具统计学意义。3研究结果3.1文献整理结果通过梳理古籍,发现在《黄帝内经》中就有多篇文章阐述时令季节因素与脏腑功能变化相关联,同时结合临床诊断、治疗、养生防病做了大量论述,这为中医学理论与临床诊断的发展,为后世医家依据时令季节观察脏腑生理病理变化,研究五脏功能实质奠定了基础。其后诸多医家也在四时因素对疾病诊断治疗的影响上提出了各自的见解。这些都为现代从时间角度研究藏象实质提供了很多文献依据。3.2实验研究结果3.2.1褪黑素与下丘脑-垂体-性腺轴相关激素的季节性变化正常生理状态下血浆和性腺轴各组织中MT、MR、GnRH、FSH、LH、T的含量都呈现季节性的变化趋势(p<0.05)。血浆MT含量、下丘脑组织中MT和MR含量、睾丸组织中MT含量都在春冬高于夏秋；垂体组织中MT含量春夏较高、秋冬较低,MR含量夏秋高于春冬；睾丸组织中MR含量春秋高于夏冬。血浆GnRH、T的含量秋冬高于春夏；FSH、LH的含量春秋高于夏冬。下丘脑组织中GnRH含量、垂体组织中LH、FSH含量及睾丸组织中T的含量都大致呈现由春分向冬至递减的趋势。相关性分析显示性腺轴组织上MT、MR的含量变化与组织中激素含量变化具有一定程度的相关性。实验说明性腺轴的功能具有四时变化的特点,褪黑素可能在这变化过程中发挥了调控作用。3.2.2下丘脑-垂体-性腺轴各组织中AANAT、HIOMT活性的季节性变化正常生理状态下下丘脑、垂体、睾丸组织中AANAT、HIOMT的活性都呈现季节性的变化趋势(P<0.05),与同组织中的MT含量季节变化趋势基本一致。下丘脑和睾丸组织中AANAT、HIOMT活性都表现为春冬高、夏秋低的变化特点；垂体组织中AANAT、HIOMT活性春夏较高、秋冬较低。相关性分析显示下丘脑、垂体、睾丸组织中MT含量与同组织中AANAT、HIOMT活性呈正相关关系(P<0.05),能随季节发生同步性变化。实验说明性腺轴上各组织能合成少量MT, MT含量的季节性变化受到了AANAT、HIOMT活性季节节律的影响。3.2.3下丘脑-垂体-性腺轴各组织中c-fos和c-jun mRNA表达的季节性变化正常生理状态下下丘脑、垂体组织中c-fos mRNA和c-jun mRNA,睾丸组织中c-jun mRNA的表达强度呈现四季变化的特点(P<0.05),c-fos mRNA在下丘脑组织中春夏较秋冬表达强烈,在垂体和睾丸组织中秋冬较春夏表达强烈,但在睾丸组织中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。c-jun mRNA在下丘脑、垂体、睾丸组织中都表现为秋冬较春夏表达强烈的趋势。c-fos和c-jun在垂体、睾丸组织中的季节表达趋势分别与血浆GnRH、T含量的季节变化趋势相似。实验说明性腺轴功能的四时变化与下丘脑、垂体、睾丸组织中c-fos和c-jun的季节性表达有关。4结论4.1生理状态下,下丘脑-垂体-性腺轴的功能具有应四时而变化的特点,褪黑素可能在这一过程中发挥了调控作用。4.2褪黑素能在下丘脑-垂体-性腺轴各组织上被少量合成,且受其合成限速酶季节节律的影响呈现季节性的变化。4.3下丘脑-垂体-性腺轴功能的四时变化与细胞信号转导物质的季节性变化有关。4.4以上结论为“四时五脏阴阳”理论的研究提供了实验依据。