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苦荞(Fagopyrum tataricum)为蓼科荞麦属植物,是一种传统的药食两用小杂粮作物。苦荞富含芦丁等黄酮类化合物,具有防止血管硬化、抗衰老和增强机体免疫力等功效,在医药和保健食品领域具有广阔的应用前景。芦丁作为苦荞主要的质量性状,阐明芦丁合成调控机制成为苦荞研究重点,对提高苦荞黄酮含量意义重大。黄酮合成途径是植物苯丙烷代谢途径的一个分支,该代谢途径同时受多种转录因子的调控,其中R2R3-MYB转录因子家族是重要一员。本研究以苦荞品种“西荞2号”为材料,克隆获得转录因子FtMYB5序列,鉴定其分子特征,分析其表达的组织特异性和光应答特性,明晰其对烟草黄酮积累及黄酮合成相关基因表达的影响。本研究初步揭示了苦荞FtMYB5参与黄酮代谢调控的分子机理,为未来采用代谢工程技术提高苦荞黄酮含量提供了理论参考。主要研究结果如下:1.根据苦荞花期转录组数据,克隆获得一条与拟南芥AtMYB111同源的R2R3-MYB基因序列,命名为FtMYB5。构建pBridge-FtMYB5酵母表达载体,转化AH109酵母细胞,经SD/-Trp/-His双缺培养筛选获得阳性转化子。β-半乳糖苷酶活性滤纸分析表明,FtMYB5在酵母中具有转录激活活性。构建FtMYB5的黄色荧光蛋白融合表达载体PA7-FtMYB5-YFP,通过PEG-Ca介导法转化拟南芥原生质体,荧光观察表明FtMYB5定位于细胞核。2.采用qPCR测定了花期苦荞各组织中FtAMYB5的表达量。结果表明,FtMYB5表达模式与苦荞黄酮代谢途径各结构基因具有类似的组织表达模式,提示FtMYB5可能参与了苦荞黄酮合成的调控。采用光照及黑暗处理芽期苦荞,比较分析黄酮合成相关基因的表达和黄酮含量。结果表明,FtMYB5能够快速应答光刺激,6h达到表达量峰值,为 Oh 对照组的 16.9 倍,且FtPAL、FtCHSI、FtCHI、FtF3’H、和 FtFLS1 也能够响应光刺激,且与FtMYB5具有类似的表达模式。同时,光照处理下12h后,苦荞总黄酮含量显著提升(P<0.05),总黄酮含量保持较高水平。以上结果说明,苦荞黄酮合成相关结构基因可能直接应答光照,或者受到具有光应答效应转录因子FtMYB5的次级调控来影响苦荞黄酮的合成。3.采用融合引物嵌套PCR(FPNI-PCR)技术克隆获得长度为1576bp的FtMYB5基因5’UTR序列。序列分析表明,该序列含有6个可能的启动子核心区域和真核启动子必须的TATA-box和CAAT-box。此外,该序列还含有Box4(ATTAAT),GATA box(GATA),GT1 CONSENSUS(GRWAAW),GT1CORE(GATAA),IBOXCORE(GATAA),INRNTPSADB(YTCANTYY)和 SORLREP3AT(TGTATATAT)等多个光应答相关的启动子元件。转基因拟南芥组织化学染色分析表明,该启动子可以在子叶、叶和花中驱动GUS表达。光照及黑暗处理分析表明,该启动子具有光应答效应。4.构建pCAMBIA1301-35S-FtMYB5植物表达载体,采用农杆菌浸染法转化烟草,分析阳性转基因烟草中黄酮醇含量和黄酮合成途径相关结构基因的表达量。结果表明,FtMYB5过表达烟草中芦丁、槲皮素和山奈酚等三种黄酮醇以及总黄酮含量显著增加(P<0.05),花青素含量显著降低,烟草花色变浅。基因表达量分析表明,转基因烟草中的NtPAL、NtCHI、tNtF3’H和NtFLS等基因表达显著上调(P<0.05),而花青素合成支路的DF’R基因表达量无显著变化(P>0.05)。综上表明,苦荞转录因子FtMYB5的表达具有光应答效应,进一步可通过上调PAL、CHS、CHI、F3’H和FLS等基因的表达,使代谢流主要流向黄酮醇合成支路,从而增加黄酮醇的积累,降低花青素的合成。