布氏田鼠肠道真菌多样性分析及分离鉴定

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布氏田鼠分布广泛,主要分布于俄罗斯、蒙古及我国东北部,是鼠疫等人畜共患病的主要传播者。但是肠道中还有许多未知的微生物,其肠道内携带真菌还未可知,所以我们通过高通量测序技术联合培养组学的方法研究了内蒙古东部乌珠穆沁旗市26只野生布氏田鼠肠道真菌,具体结果如下:ITS(Internal Transcribed Spacer)扩增子测序结果显示:在门水平上,基于1%的阈值发现的真菌菌门共4种,分别为子囊菌门(Ascomycota),担子菌门(Basidiomycota),毛霉门(Mucoromycota)和壶菌门(Chytridiomycota),其中雄性组和雌性组共有的优势菌门为子囊菌门和担子菌门;在目水平上,雄性布氏田鼠组中毛霉菌目(Mucorales)的占比显著高于雌性组;在属水平上,雄性布氏田鼠组中卷霉属(Circinella)的占比显著高于雌性组。差异性分析结果显示,雄性布氏田鼠组有显著差异影响物种共19个物种,其排列顺序从高到低分别是:粘菌纲(Mucoromycetes)、毛霉菌目(Mucorales)、毛霉门(Mucoromycota)、卷霉属(Circinella)、地衣科(Lichtheimiaceae)、Circinella nodulosa、亮白曲霉(Aspergillus_candidus)、青霉属(Penicillium)、Condenascus属、Condenascus tortuosus、Apiotrichum属、Cephalotrichum asperulum、伞菌纲(Agaricomycetes)、Penicillium bilaiae、亚隔孢壳属(Didymella)、Gamsia属、Beauveria felina、白僵菌属(Beauveria)、虫草菌科(Cordycipitaceae),而雌性布氏田鼠组有显著差异影响的物种只有1种:黑粪藓科(Phaeosphaeriaceae)。真菌表型预测结果显示,布氏田鼠肠道内腐生营养型真菌占60%左右,其次分别为共生营养型真菌和病理营养性真菌。将采集的盲肠内容物样品基于培养组学技术,利用ITS测序及传统培养组学相结合的方法对布氏田鼠肠道真菌菌群进行研究。本试验共分离出589株真菌,最终鉴定出194株真菌菌株,隶属于3个门,10个纲,16个目,21个科,34个属,61个种。分离最多的真菌菌种为Meyerozyma athensensis(n=50,25.77%)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)(n=16,8.25%)及Preussia persica(n=10,5.15%)。实验同时证明了ITS扩增子分析可以和培养组学相互验证,利用培养组学技术可以培养出更多ITS测序技术中无法被注释的物种,在194株真菌基因序列中有13株真菌序列与已知菌种的相似度<98.5%,可能为潜在的新菌种。此外,实验分离的部分功能真菌可用与特定领域的相关研究,如:锥毛壳属(Coniochaeta)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)、胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)等。在已成功分离出的肠道真菌中,选取布氏田鼠肠道核心菌门占比最多的子囊菌门中的20株不同科水平的真菌进行全基因组二代测序。结果显示20株真菌共来自7个属,包括假丝酵母属3株、曲霉属5株、毛壳菌属1株、青霉菌属1株、锥毛壳属1株、镰刀菌属1株、Meyerozyma属8株。其中共有11株菌鉴定到种水平,分别是季也蒙毕赤酵母8株、灰绿曲霉2株、假丝酵母1株。采用生物信息学分析的方法对其含有的相关功能基因进行分析,CAZy基因注释表明,20株真菌中与糖苷水解酶和糖基转移酶相关的基因数量最多;KEGG功能注释表明,蛋白质代谢、碳水化合物代谢及转录相关的基因的数量最多,同时存在较多与人类疾病类通路有关的基因。综上所述,本研究首次构建了布氏田鼠肠道真菌菌种库,完成了布氏田鼠肠道真菌功能的初步预测,具有重要的科学价值及意义。
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