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树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是免疫系统的专职抗原呈递细胞(Antigen-presenting cells,APC)。其作为一种异质性细胞群体,数量较少,但广泛地存在于外周组织中。同时DCs也是专业的吞噬细胞,能够高效地吞噬寄生虫,细菌等病原体。与巨噬细胞不同的是,DCs能够摄取抗原肽信息,上调其共刺激分子、主要组织相容性复合体分子(Major histocompatibility complex,MHC)和细胞黏附分子(Cell adhesion molecules,CAMs)表达水平。DCs的趋化、迁移以及侵袭功能使其在受到外界刺激逐渐成熟的过程中从外周组织迁移至淋巴组织和器官,刺激T细胞增殖活化产生免疫应答,从而清除病原体并维持体内免疫稳态。DCs作为连接特异性免疫和固有免疫的重要桥梁,对于其功能调控的相关研究能够为DCs在传染病、自身免疫性疾病和癌症等疾病的预防和治疗中的作用提供理论依据,是国内外免疫学界研究的热点。目前研究指出,叉头框(Forkhead box,Fox)蛋白作为一种转录因子,在调节机体免疫稳态中具有一定作用,同时它也是调控多种细胞反应的重要调控因子。有研究发现FOXO1敲除鼠的DCs与CD4~+T细胞结合的能力与激活CD4~+T细胞增殖的能力降低,同时激活B细胞产生抗体的能力也降低。此外,体内DCs归巢实验、体外Transwell迁移及吞噬实验证实,敲除FOXO1后,小鼠DCs归巢及迁移能力显著降低。过表达细胞粘附分子1(Intercellular Adhesion Molecule 1,ICAM-1)与CC趋化因子受体7型(C-C chemokine receptor type 7,CCR7)后,可显著逆转DCs受损的功能,由此推测FOXO1通过调控其下游靶基因介导DCs活性的上调。由于磷酸化FOXO1由核内转移至胞质中,导致其转录活性的抑制,我们推测影响其磷酸化水平可以实现对DCs功能的调控。细胞周期蛋白依赖性激酶5(Cyclin-dependent kinase 5,Cdk5)激酶是一种在神经元发育、突触可塑性和神经传递中起到重要作用的丝氨酸/苏氨酸激酶。此前关于Cdk5的报道多见于神经退行性疾病以及癌症的研究中。在过去的几年中,Cdk5在免疫学领域的角色逐渐得到关注。Roscovitine是一种强效的Cdk抑制剂,对于Cdk5的激酶活性有一定的抑制作用。有研究发现,在神经元细胞中,Cdk5能够磷酸化转录因子FOXO1,导致其下游基因转录活性的抑制,而目前对DCs中Cdk5对FOXO1以及FOXO1下游靶基因乃至对DCs的功能调控的研究相对较少。综上所述,我们推测Cdk选择性抑制剂Roscovitine对Cdk5的激酶活性的抑制能够调控DCs中FOXO1的亚细胞定位,影响FOXO1转录活性,从而改变DCs的功能与活性。研究目的:本研究以小鼠DC2.4细胞系为实验对象,旨在研究给予Roscovitine后DC2.4的克隆形成、吞噬、迁移、侵袭功能与增殖活性的变化。并研究Cdk5与FOXO1在DC2.4细胞中的相互作用,探索Roscovitine影响DC2.4细胞功能的作用机制,为DC细胞生物学研究提供新的视角。实验方法:以DC2.4细胞系为实验对象,采用MTT实验检测不同Roscovitine浓度作用下细胞的存活率;采用克隆形成实验,检测DC2.4细胞克隆形成能力的变化;流式细胞术检测DC2.4细胞吞噬能力;采用Transwell小室迁移实验检测DC2.4细胞迁移能力;采用Transwell基质侵袭实验检测DC2.4细胞侵袭能力;采用免疫荧光染色法检测FOXO1在DC2.4细胞内的分布情况;使用核质分离试剂盒提取DC2.4细胞的细胞质蛋白与核蛋白;采用RT-qPCR检测DC2.4细胞内ICAM-1和CCR7的mRNA表达水平;免疫印迹法检测DC2.4细胞中FOXO1的Ser249位点磷酸化水平;采用质粒转染方法激活或抑制Cdk5的激酶活性。实验结果:(1)Roscovitine对DC2.4细胞增殖能力的影响:MTT结果表示:Roscovitine给药浓度在30μM及以上时,细胞活力过低,分别为30μM:(42±3.49)%;100μM:(20±2.28)%。(2)Roscovitine对DC2.4细胞克隆形成能力的影响:与DMSO组相比,当Roscovitine给药浓度大于20μM时,细胞形成克隆能力被显著抑制(P<0.001)。因此,我们确定Roscovitine给药浓度为20μM。(3)Roscovitine对DC2.4细胞吞噬能力的影响:与DMSO组和LPS预刺激组相比,Roscovitine 20μM组的FITC阳性率显著上升(P<0.05,P<0.01)。(4)Roscovitine对DC2.4细胞迁移能力的影响:与DMSO组相比,Roscovitine 10μM组以及Roscovitine 20μM组迁移至小室膜下室侧的DC2.4细胞数量显著减少(P<0.01)。(5)Roscovitine对DC2.4细胞侵袭能力的影响:与DMSO组相比,Roscovitine 10μM组以及Roscovitine 20μM组侵袭到小室膜的下室侧的DC2.4细胞数量显著减少(P<0.01)。(6)Roscovitine对DC2.4细胞中FOXO1胞内分布定位的影响:与DMSO组相比,Roscovitine处理组的FOXO1在胞质内的荧光信号减少,在核内的荧光信号增强,LPS预刺激的DC2.4细胞在给与Roscovitine后产生同样的现象;提取细胞质蛋白和细胞核蛋白后免疫沉淀的结果显示,与DMSO组相比,Roscovitine 20μM组细胞质中FOXO1含量显著减少(P<0.01),对LPS预刺激的DC2.4细胞给与Roscovitine 20μM处理同样显著减少胞质中FOXO1含量(P<0.01)。与DMSO组相比,Roscovitine 20μM组核蛋白中FOXO1的增加较为显著(P<0.01)。与LPS组相比,LPS+Roscovitine 20μM组核蛋白中FOXO1含量显著增加(P<0.001)。(7)Roscovitine对DC2.4细胞中ICAM-1、CCR7 mRNA表达的影响:与DMSO组和LPS预刺激组相比,Roscovitine 20μM处理后DC2.4细胞中CCR7的mRNA水平显著上升(P<0.05),ICAM-1的mRNA水平无显著变化。(8)Roscovitine对DC2.4细胞中FOXO1蛋白磷酸化水平的影响:与DMSO组以及LPS组相比,Roscovitine 20μM处理显著下降FOXO1于Ser249位点的磷酸化水平(P<0.01)。(9)DC2.4细胞中Cdk5对FOXO1的磷酸化作用:在转染了FOXO1-WT的各组中,与GFP组相比,Cdk5/p25组和Cdk5/p35组的FOXO1在Ser249位点的磷酸化水平显著上升(P<0.05,P<0.01),Cdk5-DN/p25组以及Cdk5-DN/p35组的FOXO1磷酸化水平显著降低(P<0.01);在转染了FOXO1-S249A的各组中,与GFP组相比,Cdk5/p25组和Cdk5/p35组的FOXO1磷酸化水平无显著变化,Cdk5-DN/p25组以及Cdk5-DN/p35组的FOXO1磷酸化水平显著降低(P<0.05)。(10)Cdk5的激酶活性对DC2.4细胞迁移的影响:与GFP空载组相比,FOXO1-WT组的迁移能力显著升高(P<0.01);在转染了FOXO1-WT的各组中,与GFP组相比,Cdk5/p25组迁移能力明显下降(P<0.01),Cdk5-DN/p25组与Cdk5/p25组相比迁移能力提高(P<0.05);FOXO1-S249A与Cdk5/p25共转染组较FOXO1-WT与Cdk5/p25共转染组的迁移能力明显增加(P<0.05)。(11)Cdk5的激酶活性对DC2.4细胞侵袭的影响:与GFP组相比,FOXO1-WT组的侵袭能力显著升高(P<0.01);在转染了FOXO1-WT的各组中,与GFP组相比,Cdk5/p25组的侵袭能力显著降低(P<0.01),而Cdk5-DN/p25组与Cdk5/p25组相比侵袭能力提高(P<0.01);FOXO1-S249A与Cdk5/p25共转染组较FOXO1-WT与Cdk5/p25共转染组的侵袭能力明显增加(P<0.05)。(12)Cdk5的激酶活性对DC2.4细胞吞噬能力的影响:流式细胞术结果显示,与GFP空载组相比,FOXO1-WT组的FITC阳性率显著增加(P<0.01);而在转染了FOXO1-WT的各组中,Cdk5/p25组的阳性率较GFP组明显减小(P<0.05),Cdk5-DN/p25组的阳性率明显高于Cdk5/p25组(P<0.05);FOXO1-S249A与Cdk5/p25共转染组较FOXO1-WT与Cdk5/p25共转染组的阳性率明显增加(P<0.05)。(13)Cdk5的激酶活性对FOXO1核转位的影响:免疫荧光染色结果显示,在转染了WT-FOXO1的各组中,与GFP组相比,Cdk5/p25组的FOXO1更多地出现在细胞质中。与Cdk5/p25组相比,Cdk5-DN/p25组的FOXO1更多的出现在细胞核内;与DMSO组相比,Roscovitine 20μM处理后,Cdk5/p25组的FOXO1更多的出现在细胞核中。实验结论:(1)Roscovitine预处理能够增强DC2.4细胞吞噬能力,抑制DC2.4细胞迁移以及侵袭的能力,此抑制作用不依赖于Cdk5的活性。(2)Roscovitine预处理可能通过抑制Cdk5的激酶活性,降低FOXO1在Ser249位点的磷酸化水平,促进FOXO1入核,从而增强DC2.4细胞的吞噬功能。(3)在DC2.4细胞中,Cdk5能够磷酸化FOXO1于Ser249位点,使FOXO1磷酸化出核,从而抑制FOXO1对DC2.4细胞功能的活化。