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目的:端粒(telomere)是真核生物染色体末端的重复DNA序列,能够维持和保护染色体结构的稳定,避免遗传信息在复制过程中丢失:此外,它还参与细胞重要的生命过程,如寿命维持、衰老和凋亡等。端粒酶(telomerase)是端粒复制所必需的一种特殊的DNA聚合酶,在端粒受损时能够促进端粒的合成,使端粒序列自我复制延长以维持端粒长度。因此,端粒酶也属于反转录酶。人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)是端粒酶的催化亚单位,也是端粒酶的限速酶,在端粒酶活性中发挥着关键作用。研究发现,hTERT的表达上升是正常细胞向肿瘤细胞转化过程中所必须的,因而被认为是肿瘤发生的风向指标。在肿瘤细胞中,hTERT 能够调节多种侵袭相关蛋白,如matrixmetalloprotease 9(MMP9),transforming growth factor b1(TGF-b1),integrin b1(ITGB1),heparanase(Hpa)等。hTERT 能够与 β-catenin 相互作用,进而调节Wnt信号通路;能够影响p65的水平,进而影响NF-κ B通路;还能够影响TGF-β/Smad信号,并对c-myc表达水平产生影响。hTERT还可以影响干细胞因子CD117、Oct4和Sox-2等,从而促进肿瘤细胞向肿瘤干细胞的转变。然而,hTERT表达在正常细胞中如何失活,在肿瘤细胞中又是如何被激活的机制仍有待探索。实验室前期研究发现SPT6能够调控hTERT表达参与结肠癌生长的进程,在此基础上,本文拟通过研究在结肠癌中发现和鉴定能够协同SPT6调节hTERT的共转录调控因子,并进一步探索相关转录调控机制以及在结肠癌发生发展中的功能和临床意义,为结肠癌靶向治疗提供实验依据。方法:(1)在结肠癌细胞系中,通过免疫共沉淀实验和蛋白质组学分析发现并鉴定能够与SPT6相互作用的蛋白。(2)应用RNA干扰技术,抑制能够与SPT6相互作用的蛋白的表达,分析其自身对hTERT转录的影响以及其表达水平改变在SPT6介导的hTERT转录表达调控和肿瘤的增殖、干性等生物学功能中的影响。(3)通过小鼠动物模型,进一步验证SPT6调节hTERT进而影响肿瘤细胞肺部转移的功能。(4)在结肠癌细胞株中,验证SPT6及共转录因子通过调节hTERT进而影响化疗敏感性。(5)通过免疫组化等实验检测病人组织中hTERT及共转录因子的表达情况,并分析三者表达的相关性。结果:(1)通过免疫共沉淀实验发现鉴定了能够协同SPT6调节hTERT转录表达的共转录因子SND1,并验证SND1能够结合在hTERT启动子区。(2)敲低SND1抑制了 hTERT转录和表达,并逆转了 SPT6过表达所介导的hTERT转录和表达的上调以及肿瘤细胞的增殖和干性的促进。(3)体内实验表明,SPT6敲低可抑制结肠癌细胞的肺部转移和转移相关蛋白的表达。(4)SPT6敲低表达上调了结肠癌细胞对于化疗药物的敏感性,而SND1敲低表达则可以逆转SPT6过表达引起的化疗敏感性的降低。(5)免疫组化分析表明SND1和hTERT在肿瘤组织中高表达,SND1与SPT6和SND1与hTERT的表达均具有显著相关性。结论:本文通过研究,发现并鉴定出了协同SPT6调控hTERT转录表达的共转录因子SND1,明确了其自身对于hTERT表达及结肠癌细胞增殖和干性维持的促进作用,并进一步明确了其在SPT6所介导的hTERT的表达调控以及结肠癌细胞增殖和干性维持中所发挥的协同作用。临床数据分析表明SPT6、SND1和hTERT表达有正相关性,可能对肿瘤的诊断和预后有重要意义。本研究有望为结肠癌的临床诊断和治疗提供新的潜在靶点。