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研究背景和目的:药物代谢酶(Drug metabolizing enzymes,DMEs)作为代谢药物和内源性物质的重要酶类,其活性和表达受许多体内和体外因素的影响。研究表明,药物代谢酶在不同年龄段的活性和表达不同[1]]。在研究过程中,由于人类样本涉及伦理道德审查,因此在临床前实验中,通常使用动物模型对实验原理和机制进行研究。野生型FVB小鼠常作为临床前药代动力学实验研究的工具鼠,其代谢酶随年龄的变化规律目前尚未报道研究。此外,针对特定化合物,外排转运蛋白和药物代谢酶之间可能存在相互作用。乳腺癌耐药蛋白(Breast Cancer Resistance protein,BCRP/Bcrp)是最常见的外排转运蛋白之一,广泛影响着药物代谢酶的性质[2]。野生型FVB小鼠也常用于外排转运蛋白敲除背景鼠,敲除Bcrp1后药物代谢酶在各个年龄段的表达和活性是否引起改变也鲜有报道。因此,本实验研究了野生型FVB和Bcrp1-/-鼠肝脏代谢酶的活性和表达随年龄的变化规律。基于以上研究背景,本论文研究了 FVB小鼠肝脏中7种与人同源性较高的代谢酶亚型(Cyp3a11、Cyp2d22、Cyp2e1、Cyp1a2、Ugt1a1、Ugt1a6a、Ugt1a9)的活性、蛋白表达、催化能力及mRNA表达随年龄的变化规律,以阐明年龄变化对上述7种代谢酶活性和表达规律的影响;并研究了不同年龄Bcrp1-/-小鼠药物代谢酶的改变,为研究代谢酶和BCRP之间相互作用的提供参考。实验方法:本实验选用1天(新生)、1和3周(哺乳期)、6和9周(青少年期)、17和26周(成年期)、42周(中老年期)和52周(老年期)的FVB和Bcrp1-/-小鼠的肝脏样本,对各个年龄段的7种亚型的活性和表达进行了更加全面的研究。本实验分别选取7种亚型的特异性探针底物对各个代谢酶的代谢速率进行评价;建立了UHPLC-MS/MS蛋白绝对定量方法,采用设计非同位素标记探针多肽对各个样本中7种亚型进行蛋白绝对定量;采用Real-Time PCR方法研究肝脏组织中7种药物代谢酶的mRNA表达水平。催化能力通过各亚型的代谢速率和对应的蛋白量计算出的Turnovernumber(TON)来阐明。并通过统计学分析,进行活性、蛋白表达、催化能力和mRNA表达之间的相关性分析。实验结果:1.FVB和Bcrp1-/-小鼠肝中7种代谢酶的代谢速率随年龄的变化规律1.1 FVB小鼠中,Cyp3a11、Cyp2d22和Cyp2el在1-3周达到最大代谢速率,而Cyp1a2、Ugt1a1、Ugt1a6a和Ugt1a9则在6-9周达到最大代谢速率。1.2在Bcrp1-/-小鼠中,Cyp3a11、Cyp2d22和Cyp2e1在1-3周达到最大代谢速率,Cyp1a2、Ugt1a1、Ugt1a6a和Ugt1a9在6周达到最大代谢速率。1.3敲除Bcrp1后,Cyp3a11的活性在刚出生时下降了 61%;Cyp2d22的活性的活性从新生到9周分别下降了 82.5%、53.5%、37.1%、62.9%、和54.3%,Cyp2e1的活性在6、9、17周时分别上升1.61、2.11、2.36倍,Ugt1a6a的活性在6周时上升了 2.18倍;Ugt1a9的活性在新生和1周时上升1.19和1.56倍。2.FVB和Bcrp1-/-小鼠肝中7种代谢酶的蛋白表达随年龄的变化规律2.1 在 FVB 小鼠中,Cyp3a11、Cyp2d22、Cyp2e1、Cyp1a2、Ugt1a1、Ugt1a6a 的蛋白量均在6-9周达到最大值。2.2在Bcrp1-/-小鼠中,Cyp3a11的蛋白在增长至3周后保持稳定,Cyp2d22、Cyp1a2和Ugt1a9的蛋白量随年龄的增长而增长,而Ugt1a1的蛋白量在1周达到最大表达。2.3敲除Bcrp1后,Cyp2d22和Cyp2e1在各个年玲段的蛋白含量均为发生显著性变化,均在1倍以内;而Cyp3a11的蛋白量在6周时下降了 51%,Cyp1a2的蛋白量在9周下降了 73.5%,但在52周上升了 1.20倍,Ugt1a1在6、9、26周分别下降了 59.2%、84.7%和 56.3%。3.FVB和Bcrp1-/-小鼠肝中7种代谢酶的mRNA随年龄的变化规律3.1 在 FVB 小鼠中 Cyp3a11、Cyp2e1、Cyp2d22、Cyp1a2、Ugt1a6a 和 Ugt1a9 在 17周达到最大的mRNA表达;而Ugt1a1则在3周达到最大表达。3.2 在 Bcrp1-/-小鼠中Cyp3a11、Cyp2e1、Cyp2d22、Cyp1a2、Ugt1a1、Ugt1a6a和Ugt1a9均在17周达到最大的mRNA表达。结论:本实验研究了 FVB小鼠中7种代谢酶的活性和表达从新生到老年的变化规律以及在各个年龄段敲除Bcrp1后药物代谢酶的变化。研究发现在FVB小鼠中Cyp3a11、Cyp2d22、Cyp2e1在哺乳期达到最大代谢速率,而Ugts则在青春期达到最大代谢速率;Cyp3a11、Cyp2d22、Cyp2e1、Cyp1a2、Ugt1a1、Ugt1a6a 的蛋白含量均在青春期达到最大表达。而敲除Bcrp1之后,部分亚型的活性和蛋白表达在不同年龄段发生改变,但大部分亚型的活性和蛋白在敲除Bcrp1后Ratio值均在0-2内,提示Bcrp在不同年龄段对药物代谢酶性质的影响程度不同。本实验结果显示各亚型的活性和表达随年龄变化存在亚型特异性,并具有亚型特异性,并且发现BCRP外排转运蛋白和药物代谢酶存在相互影响,但BCRP影响代谢酶的活性和表达的机理,还需进一步的研究。