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前言:肺癌是一种常见恶性肿瘤,已成为人类癌症死亡的主要原因之一。其中小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)约占原发性肺癌的15%～20%,是肺癌中分化最低、恶性程度最高的一种。此型肺癌初次对化疗敏感,但容易复发、产生耐药,其五年生存率不足5%。许多研究显示FGF-2,即碱性成纤维细胞生长因子(basicFibroblast Growth Factor,bFGF),能使较多肿瘤产生广谱耐药性,主要原因是其抑制了化疗药物诱导的细胞凋亡。但其抑制凋亡的机制仍不清楚。在小细胞肺癌病人血清中FGF-2异常升高,被认为是小细胞肺癌患者独立的预后指标。目前,有关小细胞肺癌中FGF-2抑制细胞凋亡的研究较少。本研究旨在探讨FGF-2介导的小细胞肺癌凋亡抑制机制。目的:(1)观察FGF-2对小细胞肺癌细胞NCI-H446的凋亡抑制作用(2)研究FGF-2对NCI-H446细胞凋亡抑制蛋白Survivin表达水平的影响和线粒体释放的促凋亡蛋白Smac的亚细胞定位的影响,以及探讨SCLC组织中FGF-2、Survivin和Smac蛋白的表达及其相关性,从而揭示FGF-2抑制NCI-H446细胞凋亡的部分机制。(3)研究PKCα信号分子在FGF-2抑制NCI-H446细胞凋亡过程中的作用以及对Survivin表达的调控作用。(4)分析经FGF-2预处理的NCI-H446肺癌细胞和未处理的NCI-H446肺癌细胞的差异蛋白表达谱,寻找与小细胞肺癌增殖与凋亡相关的分子标记物。方法:(1)采用流式细胞术(FCM)、TUNEL、Hoechst 33258染色观察FGF-2对NCI-H446细胞凋亡的影响;Western blot检测FGF-2对NCI-H446细胞Survivin表达水平的影响;利用中和型抗FGF-2抗体抑制FGF-2活性,Western blot检测Survivin蛋白表达水平的改变;Western blot和免疫荧光检测FGF-2对NCI-H446细胞中促凋亡蛋白Smac的亚细胞定位的影响。(2)应用免疫组织化学SP法分析20例SCLC组织、15例正常支气管上皮组织中FGF-2、Survivin和Smac蛋白的表达水平。(3)FGF-2作用于NCI-H446细胞,采用Western blot检测细胞总蛋白和膜蛋白中PKCα表达的变化;特异性PKC抑制剂Calphostin C预处理FGF-2刺激的NCI-H446细胞:Western blot检测细胞总蛋白和膜蛋白中PKCα表达变化、Survivin表达变化,用流式细胞术、Hoechst 33258染色、以及TUNEL分析细胞凋亡改变。(4)二维凝胶电泳技术、结合基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱技术和生物信息学,分析FGF-2预处理的NCI-H446肺癌细胞和未处理的NCI-H446肺癌细胞的差异蛋白表达谱,用Western blot及SP法探讨其中两个候选差异蛋白质在NCI-H446细胞及SCLC肺癌组织的表达情况。结果:(1)0～75ng/mlFGF-2作用NCI-H446细胞,Survivin蛋白表达强度依FGF-2浓度的增高依次增强,FGF-2浓度为100 ng/ml时,Survivin蛋白的表达略下降,所有实验组Survivin蛋白的表达均明显高于对照组(P＜0.05)。FGF-2作用NCI-H446细胞1～6h,Survivin蛋白表达显著升高,并在4h时达峰值,所有实验组Survivin蛋白的表达均显著高于对照组(P＜0.05)。(2)12.5μg/ml和25μg/ml中和型抗FGF-2抗体可有效抑制FGF-2诱导的Survivin蛋白的表达(P＜0.05),抑制程度分别为20%和34%。(3)25～100ng/ml浓度范围的FGF-2能显著抑制血清饥饿诱导的Smac从线粒体的释放,抑制程度为53%～62%,与血清饥饿组相比,差异显著(P＜0.05)。(4)75ng/ml的FGF-2可以明显抑制血清饥饿诱导的NCI-H446细胞凋亡。血清饥饿组细胞出现典型凋亡形态学改变,而FGF-2可阻断这一效应;对照组、血清饥饿组、FGF-2干预组凋亡核百分率分别为2.42±0.85,14.51±2.68,6.13±1.89;TUNEL分析三组细胞每高倍视野凋亡细胞数分别为2.52±1.15,7.65±2.21,5.32±1.25。(5)SCLC癌细胞及间质血管内皮细胞中FGF-2蛋白和Survivin蛋白广泛表达。20例SCLC组织中FGF-2蛋白的阳性表达率(95%,19/20)及Survivin蛋白的阳性表达率(100%,20/20)均显著高于正常支气管上皮组织(分别为6.7%,1/15和0%,0/15)(P＜0.05);20例SCLC组织中Survivin蛋白呈胞核胞浆双阳性表达。SCLC组织Smac蛋白的表达明显低于正常支气管上皮组织(P＜0.05);SCLC组织Survivin蛋白与FGF-2蛋白的表达呈正相关(r=0.557,P＜0.05),Smac蛋白与FGF-2和Survivin蛋白的表达无明显相关性(r分别等于-0.133和-0.024,P＞0.05)。(6)FGF-2作用NCI-H446细胞后,总蛋白中PKCα表达量无显著变化,膜蛋白中PKCα表达量增加;特异性PKC抑制剂Calphostin C预处理后,细胞总蛋白中PKCα表达量无显著变化,膜蛋白中PKCα表达量下降。Calphostin C预处理后,与FGF-2作用组比较,细胞survivin的表达量下降,细胞凋亡率增加(3.8%升至6.32%)。(7)建立了FGF-2预处理NCI-H446细胞的二维凝胶电泳图谱,通过比较分析找到了24个差异表达的蛋白质点,FGF-2预处理NCI-H446细胞中表达上调的有9个,表达下调的有15个,经过质谱鉴定了4个蛋白质点。Western blotting及免疫组织化学法结果表明:FGF-2预处理NCI-H446细胞后,Trx蛋白表达增高,Trx蛋白在SCLC癌组织中呈过度表达;FGF-2预处理NCI-H446细胞后,CuZn-SOD蛋白表达降低,SCLC组织中CuZn-SOD的表达呈显著下调。结论:(1)FGF-2可通过促进小细胞肺癌细胞株NCI-H446中Survivin蛋白的表达并抑制Smac蛋白从线粒体的释放来抑制凋亡。(2)小细胞肺癌组织Smac蛋白表达降低及Survivin与Smac蛋白的表达失衡可能是小细胞肺癌凋亡障碍的原因之一。(3)FGF-2可激活小细胞肺癌细胞中的PKCα信号转导通路。(4)FGF-2可通过PKCα信号转导途径来促进小细胞肺癌细胞Survivin蛋白的表达,从而抑制凋亡。(5)Trx可能参与了FGF-2抑制癌细胞凋亡的过程和FGF-2诱导的耐药。