论文部分内容阅读
目的:据统计,在我国恶性肿瘤的发病率和死亡率中,肺癌居于首位。2/3非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的患者在发现时已属中晚期,而中晚期肺癌病人的五年生存率很低。放射治疗是NSCLC的治疗方式之一,然而由于肿瘤内部存在着乏氧细胞,从而会对常规放射治疗产生抗拒作用,使得晚期肺癌局部治疗的效果明显减低。与低LET射线的常规放疗比较,12C离子的肿瘤放疗,在局部控制率和五年生存率等方面明显高于常规放疗。乏氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）是一种重要的转录因子,而B细胞淋巴瘤-2基因（B-cell lymphoma-2,BCL-2）作为一种重要的抗凋亡基因,HIF-1α可促进BCL-2的转录,二者在乏氧肿瘤细胞的放射抗拒中具有重要作用。本研究用walker-256腹水瘤细胞建立SD大鼠晚期肺癌动物模型,观察silibinin对受照射动物体内HIF-1α/BCL-2信号通路的调节作用,以及对晚期肺癌动物生存时间的影响。同时以人NSCLC细胞—H1299细胞为试验模型,在体外实验中,进一步观察silibinin对NSCLC细胞的放射增敏效应及其机制。方法:实验分为体外和体内两部分,在体外试验中,以带有2种高表达HIF-1α质粒的NSCLC细胞—H1299细胞作为实验对象,其中H1299/M-HIF-1α细胞为转染入突变型HIF-1α质粒的H1299细胞,其可在常氧下高表达HIF-1α,H1299/W-HIF-1α细胞为转染入野生型HIF-1α质粒的H1299细胞,其可在乏氧下高表达HIF-1α,H1299/F细胞为转染入空白质粒的H1299细胞,以H1299/F和亲本H1299细胞作为实验对照。采用Western Blot方法检测4种细胞在常氧、模拟乏氧、silibinin预处理情况下的HIF-1α和BCL-2蛋白的表达情况,并对4种细胞进行X线照射和12C离子束照射,X线照射剂量点分别设定为0、3、4、5Gy,12C离子束照射剂量点分别设定为1.5、2Gy,通过Western Blot检测受照射细胞中HIF-1α和BCL-2蛋白的表达变化,并采用MTT检测silibinin预处理后,经2GyX线照射的4种细胞生存率。体内试验中,本研究采用5周龄SD雄性大鼠为实验对象,通过尾静脉注射walker-256腹水瘤细胞建立SD大鼠晚期肺癌动物模型,以健康大鼠作为对照。采用免疫组化方法检测荷瘤大鼠在HIF-1α靶向抑制剂—3-（5’-羟甲基-2’-呋喃基）-1-苯甲基吲唑（3-[50-hydroxymethyl-20furyl]-1-benzyl indazole,YC-1）、BCL-2靶向抑制剂—2-乙基-6氨基-4-溴（1-氰-2-乙氧-2表乙）-4-色原烯-3酸（2-Amino-6-bromo-α-cyano-3-（ethoxycarbonyl）-4H-1-benzopyran-4-acetic acid ethyl ester,HA14-1）和药物silibinin预处理后HIF-1α和BCL-2蛋白的表达情况,YC-1的给药量为10mg/kg,HA14-1的给药量为25mg/kg,silibinin的给药量为35mg/kg,并且对荷瘤大鼠进行单侧右肺X线照射,累计照射15Gy,单次5Gy,联合照射组给药时间为照射前12h,利用免疫组化方法检测受照射荷瘤大鼠中HIF-1α和BCL-2蛋白的表达变化,同时观察不同处理后荷瘤大鼠的生存时间。结果:在体外实验中,Western Blot实验显示,采用silibinin预处理后,4种细胞的HIF-1α表达水平均明显降低,且伴随着BCL-2蛋白水平的下降。经X线照射后,4种细胞中的HIF-1α和BCL-2蛋白均呈现高表达,而silibinin可有效降低受照射细胞中的HIF-1α和BCL-2的表达水平。MTT结果显示,2GyX线照射后,silibinin对H1299/M-HIF-1α、H1299/W-HIF-1α、H1299/F和H1299细胞的放射增敏比（sensitive enhancement ratio,SER）分别为1.32、1.42、2.13和2.15。此外,Western Blot结果显示,12C离子束明显抑制HIF-1α/BCL-2信号通路。在体内实验中,免疫组化结果显示,当采用YC-1、HA14-1和silibinin预处理后,荷瘤大鼠的HIF-1α表达水平均明显降低,BCL-2的表达水平也同时降低。经X线照射可明显导致荷瘤大鼠肺部肿瘤组织中HIF-1α和BCL-2的表达增加,采用YC-1、HA14-1和silibinin预处理后,可明显抑制X线诱导的HIF-1α和BCL-2表达增高。同时,silibinin可显著延长受照射荷瘤动物的生存时间。结论:silibinin可明显抑制NSCLC细胞中的HIF-1α/BCL-2信号通路,从而提高了NSCLC细胞的放射敏感性,并且在受照射的晚期肺癌动物模型中,silibinin也显著降低射线诱导的肿瘤组织中HIF-1α和BCL-2的高表达,有效延长受照射动物的生存时间。此外,12C离子束对HIF-1α/BCL-2通路显示出强烈的阻断作用,从而部分解释了12C离子照射对肺癌细胞的有效杀伤作用。