研究背景卵巢上皮性恶性肿瘤是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,其发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌,位于妇科恶性肿瘤的第三位,全球每年新诊断病例约24万人,死亡病例约15万人。虽然近年来由于TC(紫杉醇、卡铂)、TP(紫杉醇、顺铂)、DC(多西他赛、卡铂)等有效化疗方案的应用,使得卵巢癌的治疗效果有了明显提高,但是其5年生存率也仅仅在25%-30%之间。现在对于复发性卵巢癌缺乏有效的治疗手段,因此目前对于卵巢上皮性癌的治疗效果一直未能与卵巢恶性生殖细胞肿瘤那样出现质的飞跃,导致卵巢恶性肿瘤致死率居妇科恶性肿瘤的首位。卵巢癌的高死亡率主要是归功于肿瘤细胞出现对细胞毒类的化疗药物抵抗和一些细胞克隆发展成复发肿瘤,因此对化疗药物耐药是卵巢癌治疗过程中常见并且是富有挑战性的问题。转化生长因子β激活激酶1(TAK1或称MAP3K7)是细胞内的分子中心,于1995年经对c DNA文库筛选和蛋白碎片互补分析时在转化生长因子β通路中被发现,它调控着NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶MAPK信号通路,在细胞生存,免疫应答,新陈代谢和致癌中起到关键作用,其主要通过TAK1-NF-κB途径抑制凋亡蛋白酶的激活从而阻止了凋亡细胞的死亡导致细胞发生无限增殖,引起肿瘤的发生。最近的研究表明TAK1在多种恶性肿瘤中异常表达。由此可见TAK1在恶性肿瘤的发生发展中有着重要的作用。然而关于TAK1在卵巢癌中的表达情况以及TAK1在卵巢癌中的发生、发展中作用特别是对于耐受紫杉醇的卵巢癌中的作用,国内外相关的报道较少。基于此种情况,本研究的目的是对TAK1在卵巢癌组织和接受紫杉醇治疗复发卵巢癌组织中的表达情况进行检测,并通过RNAi技术和TAK1的特异抑制剂5Z-7-oxozeaenol抑制卵巢癌SKOV3和OVCAR3细胞系中的TAK1的表达,建立耐受醇的SKOV3PR细胞系,观察TAK1的表达情况及其对细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响;建立雌性裸鼠的移植瘤模型,观察抑制了TAK1后移植瘤对紫杉醇治疗的反应,探讨TAK1在卵巢癌中的预后价值及TAK1在卵巢癌发生发展过程中的作用,试图建立抑制TAK1在紫杉醇治疗卵巢癌中的潜在的抗肿瘤潜能,并期待这些实验室数据能够改变卵巢癌患者的临床治疗效果。第一部分 TAK1蛋白在卵巢组织及卵巢癌细胞中的差异表达及其临床意义目的:观察TAK1在卵巢癌组织及其复发组织中的表达情况,探讨TAK1的表达与卵巢癌的临床病理参数及预后之间的关系,同时观察TAK1在SKOV3细胞和耐受紫杉醇的SKOV3PR细胞之间的表达特征。方法:采用western-blotting方法检测卵巢癌细胞系SKOV3及耐受紫杉醇的SKOV3PR细胞系中的TAK1及p-TAK1蛋白的表达及Q-PCR检测两种细胞中TAK1m RNA的表达情况,采用免疫组织化学半定量法检测了原发卵巢癌组织和复发卵巢癌组织中的TAK1及p-TAK1的表达情况并随访患者的生存情况。结果:免疫组化结果分析显示在复发组织中,TAK1的表达水平要高于原发组织(p=0.0076),与之相应的,p-TAK1的活性在复发组织中的活性要高于原发肿瘤组织(p=0.021);TAK1的表达与患者FIGO分期、p53蛋白表达及有无淋巴结转移无明显相关性,但是生存分析曲线显示高表达的TAK1与较差的整体生存期(OS)显著相关(p=0.031);TAK1m RNA在SKOVPR细胞中的表达要显著高于SKOV3细胞(P=0.014);western blot结果显示TAK1及p-TAK1蛋白在SKOV3的表达要显著低于SKOV3PR细胞系中的表达(p=0.008与0.009)。结论:TAK1参与卵巢癌的发生、发展过程,对紫杉醇产生耐受的卵巢癌细胞表现出TAK1及p-TAK1的过表达,TAK1可能是卵巢癌的不良预后分子标记物。第二部分 抑制TAK1的表达对卵巢癌SKOV3及OVCAR3及耐紫杉醇的SKOV3PR细胞的生物学行为的影响目的:通过si RNA和5Z-7-oxozeaenol抑制卵巢癌SKOV3细胞SKOV3PR细胞和OVCAR3细胞中的TAK1的表达,分析沉默了TAK1的表达对不同卵巢癌细胞的增殖、凋亡及侵袭能力的影响,观察TAK1沉默后紫杉醇对不同卵巢癌细胞的细胞毒作用。方法:使用两个独立的TAK1靶向si RNAs(signal Silence（？）siRNAⅠ#6317和Ⅱ#6318)转染SKOV3和OVCAR3细胞,同时设立阴性对照组siRNAs(signal Silence（？）control si RNA#6201),western blotting方法检测不同卵R巢癌细胞中TAK1、p-TAK1蛋白的表达。使用CCK-8实验、Annexin V-FITC/PI双标记试验和流水细胞实验分析转染抑制TAK1后的肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性变化及经过紫杉醇处理和5Z-7-oxozeaenol处理后的增殖、凋亡以及侵袭能力的变化。结果:沉默TAK1能够显著提高紫杉醇在SKOV3和OVCAR3细胞中的敏感性,5Z-7-oxozeaenol对于抑制TAK1的磷酸化抑制呈剂量依赖,5Z-7-oxozeaenol增加紫杉醇的细胞毒性的能力随着其浓度的增加而显著增加,在SKOV3细胞系中如无5Z-7-oxozeaenol处理,紫杉醇的IC50为2.5而在SKOV3PR中,如无5Z-7-oxozeaenol处理,则其IC50值为236。PI染色的SKOV3细胞使用流式细胞分析发现紫杉醇能够增加G2/M期细胞比例,而SKVO3RP细胞对此并无此种反应,而同时给予5Z-7-oxozeaenol处理后,此种现象会再现。凋亡检测发现紫杉醇组引起的凋亡与对照组相比较细胞凋亡明显上升(p=0.02)而紫杉醇+TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol组和对照组、5Z-7-oxozeaenol组及单独使用紫杉醇组相比较差异有显著意义(p=0.001)。结论:沉默TAK1的表达能够增强紫杉醇对卵巢癌细胞的细胞毒作用,5Z-7-oxozeaenol提高紫杉醇的细胞毒作用呈剂量依赖性,耐受紫杉醇的卵巢细胞对于联合使用了TAK1抑制5Z-7-oxozeaenol和紫杉醇更为敏感;联合使用紫杉醇和TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol能够诱导G2/M捕获并能促进细胞凋亡。第三部分 联合使用TAK1抑制剂5z-7-oxozeaenol和紫杉醇对无胸腺小鼠种植瘤生长的影响目的:通过TAK1抑制剂5z-7-oxozeaenol联合紫杉醇处置卵巢移植瘤动物模型,观察其对裸鼠卵巢癌移植瘤生长及裸鼠成长的影响并评估其安全性。方法:60只无胸腺雌性小鼠随机分成4组(对照组、紫杉醇组、5z-7-oxozeaenol组、紫杉醇联合5z-7-oxozeaenol组),每组15只,给予皮下注射SKOV3细胞5*106个细胞/每注射;建立卵巢癌移植瘤动物模型,待到皮下肿瘤可触及时给予紫杉醇8mg/kg和5z-7-oxozeaenol6.5mg/kg处理四周期后,处死小鼠前2小时给予腹膜腔内注射Brd U 150mg/kg,记录小鼠体重变化,称量小鼠脾脏重量及切除的肿瘤重量,肿瘤细胞悬浮呈单细胞由流式细胞仪记录肿瘤细胞总数和阳性染色肿瘤细胞数,检测肿瘤细胞增殖。结果:紫杉醇联合5z-7-oxozeaenol处理组的移植瘤质量要显著低于其他三组(p<0.01),Brd U检测肿瘤细胞百分比显著降低(p<0.01);5z-7-oxozeaenol处理的小鼠显示了更低的p-TAK1/TAK1比例(p<0.01);各组之间的小鼠体重及脾脏重量无显著差异。结论:紫杉醇联合TAK1抑制剂5z-7-oxozeaenol能够有效的抑制卵巢癌移植瘤的生长,并且其有效剂量在小鼠模型中能高度耐受。