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软骨组织工程有望实现关节软骨损伤的临床修复再生,受到众多学者的持续关注。但基于间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)的成软骨分化依然存在较多问题,尚未能获得成熟、稳定、性能较好的软骨组织结构。为进一步阐明MSCs成软骨分化过程中的关键因素,本文基于海藻酸凝胶针对MSCs培养和分化开展了一系列相关研究。海藻酸广泛应用于软骨组织工程研究,但对MSCs在海藻酸水凝胶中的生长代谢以及共培养中软骨细胞对MSCs软骨分化的影响过程等方面,目前缺乏系统认识。本研究以兔为模型动物,采用Ficoll分离液、贴壁筛选法和II型胶原酶分离鉴定MSCs和兔关节软骨细胞(Rabbit articular cells, rACs),在确立制备海藻酸水凝胶微球的针头规格之后,通过MTT活性检测、CAM/PI荧光死活染色、H&E染色、葡萄糖／乳酸代谢测定和柠檬酸钠溶解回收细胞等方面详细考察MSCs在海藻酸水凝胶微球中的生长状态,同时通过建立基于Transwe11的非接触共培养体系,探索了rMSCs成软骨分化的培养条件,并在细胞数比例rACs:rMSCs=12的条件下,考察了28天中rACs对rMSCs活性、基因表达和胞外基质合成的影响。结果发现：对比于全血清贴壁筛选法,Ficoll密度梯度离心能够分离得到更高纯度的MSCs,细胞贴壁形态呈梭状和纤维状,并且具备向骨、脂肪和软骨分化的能力；应用0.25%胰酶和0.2%II型胶原酶消化软骨组织可以得到生长状态良好的rACs,它能够较高水平表达Sox9、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)和II型胶原等软骨组织特性基因。在为期14天的培养中,对细胞活性和微球粒径分布的表征结果都表明,利用22号针头制备载细胞微球能能够制备大小均一的微球,而且最有利于微球中细胞活性的维持；选用该型号针头所制备的载细胞微球进一步经4周培养,发现rMSCs始终均匀呈圆形而悬浮在凝胶内部,少量细胞出现死亡,同时细胞活性下降至最初的68%,而微球溶解后细胞回收率维持在55%以上；在软骨诱导培养基中,添加1.25mg/mL BSA比1.25μg/mLBSA更利于维持rMSCs的存活率和活性；Transwell共培养中,在第7天时Sox9和II型胶原基因的表达量分别增长30倍和6倍,但rACs并没有促进MSCs表达特性胞外基质(GAG/DNA)分泌。本研究比较了两种rMSCs的分离方法,全面系统地研究了rMSCs在海藻酸水凝胶微球中生长代谢,首次比较了软骨诱导培养基中BSA浓度对于rMSCs在三维水凝胶微球载体中的生长特性的影响,并初步建立了基于Transwell的rMSCs与rACs共培养体系,为进一步开展体外研究MSCs与rACs的相互作用提供了重要基础。