多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是浆细胞异常增生的恶性肿瘤。为了寻找多发性骨髓瘤相关基因,本课题组利用基因芯片技术分析MM患者和正常人单个核细胞基因表达谱,结果显示DAZAP2(Deleted in azoospermia associated protein2)基因表达明显下调,并通过RT-PCR、Western blotting等实验证明。为了明确DAZAP2基因表达下调机制,我们对其进行了生物信息学分析,发现DAZAP2基因启动子区域中存在两个CpG岛(CpG1、CpG2),并且呈现高密度甲基化状态。进一步验证实验证明,CpG2甲基化后DAZAP2基因启动子活性明显下降。　　 为了阐明MM中DAZAP2基因表达下调的表观遗传学机制,我们应用TFSEARCH软件分析DAZAP2基因启动子区域中CpG2,发现HSF、p300、CREB、ADRI等一些转录因子结合位点。同时,结合亚硫酸盐-基因组测序法(Bisulphitegenomic-sequencing,BGS)获得的DAZAP2启动子区域中的甲基化位点,挑选出AP-2、CREB、c-Rel三个转录因子结合位点。用生物素5’端标记AP-2、CREB、c-Rel非甲基化(甲基化)转录因子结合位点探针,提取KM3细胞核蛋白,进行凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shitt assay,EMSA)。实验证实,通过甲基化结合位点中的胞嘧啶,能够抑制某些转录因子与其结合位点的结合,导致基因表达下调。　　 为了将DAZAP2的检测应用到临床,建立MM临床诊断辅助手段,我们拟构建DAZAP2蛋白质检测方法,首先:将DAZAP2与原核表达载体pQE30重组,并将重组质粒转化大肠杆菌JM109,用1 mmol/L IPTG诱导pQE30-DAZAP2/JM109表达融合蛋白。经Ni-NTA亲和层析柱纯化,透析处理,SDS-PAGE17 KD位置有明显条带。用纯化蛋白免疫大白兔,常规免疫后,采用ELISA和Westernblotting实验分别检测免疫血清抗体效价及特异性。收集DAZAP2多克隆抗体用于临床MM标本检测。　　 以上实验结果表明,启动子中甲基化的CpG位点在多发性骨髓瘤DAZAP2基因表达下调中起到了关键作用。通过表观遗传学分析发现:DAZAP2基因的高度甲基化使得转录因子结合大大降低,导致基因表达显著下调。制备DAZAP2多克隆抗体,建立DAZAP2蛋白质的检测方法,为临床早期诊断MM提供科学依据。