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研究背景与目的肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,近十年其发病率和死亡率均迅速上升,在我国高居恶性肿瘤死亡率的首位,已成为严重威胁人们生命健康的重大疾病。根据肺癌的生物学特性,分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC),其中NSCLC约占80-85%,近年来,随着治疗方式的改进,治疗方案的调整,肺癌的治疗取得了长足的进步,但是大部分的NSCLC患者预后仍然较差,5年生存率仍低于15%。肿瘤转移是导致肺癌患者死亡的最主要原因之一,对肺癌的转移机制研究虽然取得了很大的成绩,然仍尚不明确。越来越多的研究证据提示了miRNAs等表观遗传学在肿瘤侵袭转移中的重要作用。本课题组前期研究发现,相比于正常肺细胞,miR-493在肺癌细胞中表达普遍较低,以高转移潜能的非小细胞肺癌95D细胞株尤为明显。本研究拟在此基础上,通过建立过表达miR-493的95D稳定细胞株,利用一系列的分子细胞生物学方法对miR-493的生物学功能进行了研究,并对miR-493的靶基因进行预测和验证,进一步探讨miR-493在肺癌中的调控机制。为开发miRNA成为肿瘤多种生物学行为的分子标志物提供理论依据。方法(1)构建miR-493慢病毒载体及空白对照载体,分别转染95D细胞,建立过表达miR-493的稳定细胞系95D/miR-493,以及对照组95D/control。并用实时荧光定量PCR验证转染效果。(2)应用平板克隆形成实验、细胞生长曲线检测各组细胞的增殖能力,流式分析细胞周期,Matrigel侵袭实验和划痕实验检测细胞侵袭和转移,Hoechst染色检测凋亡和MTS法检测药物敏感性等生物学行为的变化。(3)采用实时定量PCR、WesternBlot技术检测95D、95D/control和95D/miR-493细胞中RhoC、FZD4、IGF1R这3个靶基因的表达情况。(4)利用RNAi技术干扰肺癌细胞中RhoC的表达水平,MTS法检测干扰前后细胞5天(每天检测一次)的生长状况并绘制生长曲线评价细胞的增殖能力。Transwell检测处理前后细胞的侵袭能力的变化。Western blot检测95D/miR-493和95D/si-RhoC及其各自的对照组细胞MMP2和MMP9的表达情况。(5)利用生物信息学在线预测软件分析并结合生物学功能及前期实验结果,筛选出miR-493可能的靶基因E2F1、采用实时定量PCR、WesternBlot技术检测95D、95D/control和95D/miR-493细胞中E2F1的表达情况。将miR-493和重组有E2F1的3’UTR区序列的荧光素酶报告基因共转染293细胞,24h后检测报告基因的活性。(6)利用RNAi技术干扰肺癌细胞中E2F1的表达水平,采用流式细胞术分析干扰E2F1前后的细胞周期分布,采用MTS法检测干扰前后细胞5天(每天检测1次)的生长状况并绘制生长曲线评价细胞增殖能力。Western blot检测95D/miR-493和95D/si-E2F1及对照组细胞p21、cyclin D2、ERK的表达及磷酸化状况。结果(1)以95D组中miR-493的相对表达量作为1,95D/con组和95D/miR-493组中miR-493相对表达量分别为(1.02±0.34)、(10.65±0.59),过表达组(95D/miR-493)中miR-493的表达水平明显高于空白组(95D)和阴性对照组(95D/control)(p<0.01)。(2)外源性过表达miR-493能使细胞周期发生阻滞,G0/G1期细胞比例增多(80.77±4.22)%VS95D/control (43.70±2.33)%, S期细胞比例显著减少(9.81±0.56)%VS95D/control (43.07±2.14)%；肺癌细胞的增殖能力和侵袭转移能力明显受抑制(p<0.05),而细胞凋亡和药物敏感性方面无明显变化。(3) miR-493在95D细胞能抑制RhoC的表达而对FZD4和IGF1R表达无影响。RhoC的表达沉默能抑制95D细胞的侵袭能力而对增殖能力无影响。95D/miR-493、95D/si-RhoC中的MMP2和MMP9的表达量均明显低于其相应对照组。(4)利用生物信息学在线预测软件分析并结合生物学功能及前期实验结果,筛选出miR-493可能的靶基因E2F1。实时定量PCR及WesternBlot发现E2F1的转录和蛋白水平表达均与miR-493成负相关。双荧光素酶报告基因结果证实miR-493对E2F1表达具有直接抑制作用。(5)E2F1的表达沉默能使95D细胞G0/G1期细胞比例增高,S期细胞比例减少,生长曲线结果显示E2F1干扰后细胞增殖速度减慢。95D/miR-493、95D/si-RhoC细胞cyclinD2表达明显低于对照组细胞,P21表达均高于对照细胞,ERK磷酸化程度明显低于对照组。结论(1)成功建立了过表达miR-493的稳定细胞株95D/miR-493及其对照细胞株。(2) miR-493能抑制95D肺癌细胞增殖、侵袭和转移。(3) miR-493通过靶向抑制RhoC下调MMP2和MMP9表达而抑制95D肺癌细胞的侵袭转移。(4) miR-493通过靶向抑制E2F1上调P21,下调cyclinD2和ERK磷酸化而抑制95D肺癌细胞的生长增殖。(5)在不同的细胞或组织中,miR-493作用的下游靶点也不尽相同。