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目的研究自噬调控因子Beclinl及mTOR在大肠腺瘤癌变过程中的表达差异,探讨与临床病理因素之间的相关性,并通过应用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术在大肠癌HCT116细胞株中抑制Beclin1的表达,探讨其对mTOR、 ULK1、LC3-B的影响以及对HCT116细胞株增殖与凋亡的影响,从而进一步揭示肿瘤的发生机制,为临床大肠癌的治疗提供新的靶点。方法搜集结直肠60例低级别上皮内瘤变腺瘤(low-grade intraepithelial neoplasia, LGIN).60例高级别上皮内瘤变腺瘤(high-grade intraepithelial neoplasia,HGIN)、80例腺瘤癌变组织及30例正常粘膜组织,采用免疫组织化学方法,检测Beclin1、 mTOR及LC3-B的表达,并分析与临床病理因素的关系及指标间的相关性。设计4条针对Beclinl基因的干扰RNA表达载体(pGPU6/GFP/Neo-BECN1-homo-672,pGPU6/GFP/Neo-BECN1-homo-1056, pGPU6/GFP/Neo-BECN1-homo-1179,pGPU6/GFP/Neo-BECN1-homo-1245)及阴性对照载体(pGPU6/GFP/Neo-shNC)分别瞬时转染HCT116细胞。采用Real-time PCR及Western-bl ot法筛选出1条抑制率最高的Beclin1干扰序列后,瞬时转染HCT116细胞,检测mTOR、ULK1及LC3-B在mRNA及蛋白水平的表达情况,CCK-8检测细胞增殖活性,流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测细胞的凋亡。结果1.Beclinl与LC3-B在腺瘤癌变组中的表达明显高于LGIN组及正常肠粘膜(P≤0.05),但与HGIN组无差别(P>0.05),mmTOR在腺瘤癌变组中的表达高于其他3组(P≤0.05),在HGIN与LGIN组中的表达无统计学意义(P>0.05),但均高于正常肠黏膜组(P≤0.05)。2.在腺瘤癌变组中,Beclin1与LC3-B表达与肿瘤的大小有关,mTOR及表达与肿瘤的大小及浸润有关,而在LGIN腺瘤组与HGIN腺瘤组三者与各临床病理因素无相关性。3. Beclin1 与 LC3-B两者在LGIN腺瘤组、HGIN腺瘤组及腺瘤癌变组中的表达均呈正相关(r=0.390、r=0.306、r=0.443, P≤0.05); mTOR 与 LC3-B在HGIN腺瘤组及腺瘤癌变组中的表达呈正相关(r=0.284、r=0.223,P≤0.05),而在LGIN腺瘤组中无相关。4. pGPU6/GFP/Neo-BECN1-homo-1245组转染HCT116细胞后mRNA及蛋白抑制率最高,达80%。5. pGPU6/GFP/Neo-BECN1-homo-1245组转染细胞48h后,与阴性对照pGPU6/GFP/Neo-shNC组相比,Real time PCR结果显示,ULK1与LC3-B在mRNA水平表达降低,差异有统计学意义(P≤0.05),而mTOR在两组中的表达无差异(P>0.05),Western-blot结果与之相同。6. CCK-8细胞结果显示,转染pGPU6/GFP/Neo-BECN1-homo-1245组24h,48h,72h后,细胞生存率较pGPU6/GFP/Neo-shNC组细胞明显降低(P≤0.05)。7.FCM结果显示,转染pGPU6/GFP/Neo-BECN1-homo-1245组48h后,与阴性对照pGPU6/GFP/Neo-shNC组细胞相比,细胞凋亡率明显升高(P≤0.05)。结论1.自噬及其调控因子Beclin1、mTOR在大肠腺瘤恶性转化过程中的表达有逐渐增高的趋势,与腺瘤癌变进展密切相关,可能在大肠癌变中发挥重要作用。2.在大肠腺瘤恶性转化过程中,Beclin1与LC3-B呈正相关,且与肿瘤大小相关。3.在大肠腺瘤恶性转化后期,mTOR与LC3-B呈正相关,且与肿瘤大小及浸润深度相关。4. Beclin1在HCT116细胞自噬中发挥重要的调控作用,抑制(?)Beclin1的表达,可抑制细胞的自噬活性,并能抑制细胞增殖,促进其凋亡,Beclin1基因有望成为结肠癌治疗的新靶点。