论文部分内容阅读
目的:在肿瘤的基因治疗中,使目的基因、特别是细胞毒性基因在肿瘤细胞中特异性的表达十分重要。目前研究证实,人体大多体细胞中检测不到端粒酶活性,而增殖旺盛的细胞如精原细胞和造血干细胞、特别是肿瘤细胞中端粒酶表达阳性,使之成为肿瘤基因治疗良好的广谱靶位点。其中利用hTERT启动子进行靶向性基因治疗是当前热点之一。本研究的目的是克隆hTERT启动子,并构建在其调控下LacZ基因真核表达载体,通过报告基因表达,检测该系统是否能够有效工作。同时构建hTERT启动子调控下的tk真核表达载体并将其转染肿瘤及正常细胞,观察hTERT启动子调控下的tk/GCV系统是否对肿瘤细胞系具有特异性杀伤效果。方法:根据Horikawa报导的hTERT序列设计一对上、下游引物,并在引物的两端分别引入KpnⅠ和EcoR Ⅰ位点。提取肝癌细胞系HepG2基因组DNA,以此为模板,用PCR方法将hTERT序列扩增出来,并对序列进行测序,以确证序列的正确性。用标准的分子克隆方法构建hTERT启动子和用以对照的hCMV启动子调控下的LacZ和tk基因真核表达载体。用脂质体Lipofectamine 2000将质粒pDC511 hTERT/LacZ和pDC518 hCMV/LacZ转染至人肺癌细胞系A549和正常细胞系MRC5中,通过β-Ga1染色观察hTERT启动子工作情况。同样地,将pDC511 hTERT/tk和pDC518 hCMV/tk转染A549和MRC5细胞后,提取细胞RNA,用RT-PCR方法扩增tk基因,检测tk基因mRNA转录情况;同时用MTT法观察转染后A549和MRC5在不同浓度CCV作用下对肿瘤细胞的杀伤作用。结果:成功地克隆了hTERT核心启动子-208~-+40bp序列,经测序正确并与Hotikawa报导的完全一致。成功地构建一系列分别由hTERT启动子和hCMV启动子调控下的LacZ和tk基因表达载体,包括pDC511 hTERT、pDC511 hTERT/LacZ、pDC511 hTERT/tk和pDC518 hCMV/tk。pDC511 hTERT/LacZ和pDC518 hCMV/LacZ转染A549和MRC5细胞36小时后,β-Gal染色可见pDC518 hCMV/LacZ转染