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VEGF是一种促进血管生成的生长因子,在小鼠中已被证实可以促进毛发生长。而VEGFR-2作为VEGF最初的受体,对VEGF功能起到调节作用。VEGF在人类真皮毛乳头细胞中被证实能够通过VEGFR-2激活Erk1/2信号通路进而促进细胞的生长。本研究以通过转基因手段获得的产绒量明显提高(10048)以及产绒量未发生明显改善(10056)的内蒙古阿尔巴斯转VEGF基因白绒山羊做为研究对象,同时以同一细胞系体细胞克隆羊做为对照(NT),运用Real time-PCR以及Western Blot技术探究了VEGF以及VEGFR-2在皮肤组织中的表达情况,以及VEGF转基因对皮肤组织中细胞相关信号通路的影响。主要研究内容包括: ⑴通过实时定量PCR检测NT、10056和10048皮肤组织中VEGF及相关信号通路基因mRNA的表达情况。结果显示,10056转基因绒山羊皮肤组织中VEGF表达量与NT没有显著差异,但其VEGFR-2的表达量较NT高,差异显著(P<0.05);而10048转基因绒山羊皮肤组织中VEGF的表达量相较于NT高,差异显著(P<0.05),VEGFR-2的表达量相较于NT高,且差异极其显著(P<0.01)。检测VEGF信号通路相关基因包括:PI3K,Akt,RelA,β-catenin,HIF1-α。结果显示,10048转基因绒山羊皮肤组织中β-catenin和PI3K基因的表达量与NT无显著差异,HIF1-α的表达量较NT高,差异显著(P<0.05)。10056转基因绒山羊皮肤组织中β-catenin的表达量较NT高,差异显著(P<0.05),HIF1-α和PI3K的表达量较NT低,差异显著(P<0.05)。 ⑵通过蛋白质免疫印迹实验检测三个绒山羊皮肤组织中VEGF、VEGFR-2基因以及相关信号通路基因的蛋白表达结果显示,10056转基因绒山羊皮肤组织中VEGF的表达量较NT绒山羊皮肤组组织高,为1.4倍;VEGFR2表达量较NT低,为0.9倍;Erk1/2、P-Erk、P-Akt、P38、P-P38的表达量较NT高,分别为1.54、1.14、1.92、1.3、3倍;Akt的表达量较NT低,为0.92倍。10048转基因绒山羊皮肤组织中VEGF的表达量较NT高,为1.1倍;VEGFR-2表达量较NT高,为3.1倍;Erk1/2、P-Erk、P-Akt、P38、P-P38的表达量较NT高,分别为1.74、1.1、1.24、1.19、2.26倍;Akt的表达量较NT低,为0.9倍。 ⑶产绒量明显提高的转基因绒山羊(10048)相较于同一细胞系体细胞克隆羊(NT),其皮肤组织中VEGF以及VEGFR-2基因的表达量升高,并且VEGF的高表达通过VEGFR-2引起Erk1/2表达上调,P-Erk1/2表达上调,因而激活了Erk1/2信号通路。且引起P38以及Akt基因的磷酸化情况上调。 ⑷利用内蒙古阿尔巴斯白绒山羊处于生长期的次级毛囊毛乳头细胞(Secondary hair follice dermal papilla cells,SHF-DPCs)作为实验材料,进行VEGF基因的过表达以及干扰实验,探究VEGF,VEGFR-2基因以及相关信号通路基因表达情况的变化。通过实时定量PCR检测VEGF过表达和敲减后VEGF和VEGFR-2在SHF-DPCs中mRNA的表达情况,结果表明电转VEGF164干扰质粒1(I-1)后SHF-DPCs中VEGFmRNA的表达量较电转空质粒(NC)后低,差异显著。电转VEGF164干扰质粒2(I-2)后SHF-DPCs中VEGFmRNA的表达量较NC低。电转VEGF164过表达载体(O-V)后SHF-DPCs中VEGF mRNA的表达量较NC高,且差异显著;VEGFR-2mRNA的表达量较NC高。通过蛋白质免疫印迹实验检测VEGF过表达实验和干扰实验中VEGF和VEGFR-2蛋白的表达情况,结果显示,I-1中VEGF、VEGFR-2的表达量相对NC中的表达量分别为0.6倍、0.69倍;I-2中VEGF、VEGFR-2的表达量相对于NC中的表达量分别为0.86倍、0.92倍;O-V中VEGFR、VEGFR-2的表达量相对于NC中的表达量分别为1.14倍、1.4倍。 ⑸通过蛋白质免疫印迹实验检测VEGF过表达实验和干扰实验中VEGF、VEGFR-2相关信号通路基因蛋白的表达情况,包括Erk1/2、P38和Akt基因。结果显示I-1中Erk1/2、P38、Akt的表达量相对于NC中的表达量分别为0.82倍、1.01倍、0.59倍。I-2中Erk1/2、P38、Akt的表达量相对于NC中的表达量分别为0.92倍、0.89倍、0.32倍。O-V中Erk1/2、P38、Akt的表达量相对于NC中的表达量分别为0.84倍、1.44倍、0.69倍。结果表明在SHF-DPCs的VEGF过表达实验和干扰实验中,VEGFR-2的表达量与VEGF表达量成正相关。这些结果为在内蒙古阿尔巴斯白绒山羊毛囊的发育及生长过程中VEGF相关信号通路的研究提供了实验依据。