AHL酶基因的克隆及序列分析

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以马铃薯为实验材料,对病原菌萝卜E.C.C的致病能力进行验证分析。确定实验用量为50μl菌悬液。具体分析相同吸光度下每毫升病原菌和拈抗菌芽他杆菌、苏云金芽孢杆菌的菌液中所含菌落数。结果表明,相同吸光度下不同菌种的每毫升菌液中含大致相同的菌数。然后利用马铃薯作为试验材料对现有的菌种进行筛选,得到结果是对病原菌抑制作用较好的是苏云金芽孢杆菌鲇泽变种ACCC10016,想利用农杆菌试验进一步证明所选菌种,结果没能如愿。抑病试验证明芽孢杆菌Bt4和苏云金芽孢杆菌山东亚种ACCC10314中含有水解AHLs的水解酶-AHLs水解酶。其中,Bt4和病原菌萝卜E.C.C的菌落个数比为2:15,苏云金芽孢杆菌山东亚种ACCC10314和病原菌萝卜E.C.C的菌落个数比为3:15时,就能很好的抑制病原菌对马铃薯的侵染。 分别提取芽孢杆菌的基因组DNA,和载体的质粒DNA。 根据文献发表的基因序列设计特异性引物,以芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到两个大小约为800bp的PCR产物,它们分别来自于Bt4和苏云金芽孢杆菌山东亚种ACCC10314。回收PCR产物,命名为SS1和SS10。 核苷酸序列分析表明,所扩增的两个基因片段大小均为753bp,和基因库中已知的AHLs酶N-酰基高丝氨酸内酯酶基因aiiA的同源性达96%以上,其活性部位为“106HFDH~199H221D”。和其他一些苏云金芽孢杆菌比较,同源性高达98%,其中的活性催化中心为Hisl19,Hisl88和Asp210。构建融合表达载体pGEX-SS1和pGEX-SS10,用IPTG对融合蛋白进行诱导表达,琼脂糖凝胶电泳结果表明,其大小为55kDa。然后利用亲和柱层析法纯化融合蛋白。
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