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随着大豆EST计划的完成,公共数据库中大豆EST的功能基因信息已很充分,这些为利用大豆EST数据库开展大豆功能基因的研究工作提供了条件。相关研究表明,BURP蛋白在植物生长和植物发育过程中发挥重要作用。为进一步研究BURP蛋白的功能和作用机理,从大豆中克隆出一种新的含BURP结构域的基因,并对它进行了研究。本文以拟南芥基因RD22氨基酸序列为信息探针,对大豆EST数据库进行同源检索筛选,克隆了大豆中一个新的含BURP结构域蛋白的基因,对大豆不同组织部位进行了这个基因的组织表达谱分析,并以得到的基因对大肠杆菌进行遗传转化。研究结果如下:1 Gm BURP1基因的分子克隆与分析以拟南芥BURP蛋白家族基因RD22的氨基酸序列为信息探针,BLAST检索GenBank中的大豆EST数据库,获得了一个全长为1189bp的新的BURP蛋白家族基因的cDNA序列。该cDNA序列的开放阅读框(ORF)位于第55-1104位,ORF前存在多个终止密码子。推测该cDNA序列编码349个氨基酸,预测其相对分子量为39.8KDa,等电点pI=6.11。为了进一步验证电子克隆序列的正确性,在起始密码子和终止密码子区域设计特异引物,以大豆的cDNA为模板进行PCR扩增,获得了约1200bp左右的单一条带,回收并克隆到pGEM-T Easy载体上,经DNA测序验证,我们得到1个新的BURP家族蛋白基因,该基因被命名为GmBURP1。该基因已在GenBank登录,序列号FJ649315。序列分析表明,所得序列为以ATG起始密码子开始、以TAG密码子结束的完整的蛋白编码基因,推导的氨基酸序列具有典型的BURP家族蛋白的序列结构特征。2 GmBURP1基因的原核表达和亚细胞定位将该基因克隆到表达载体pET28a上,转化E.coli表达菌株Rosetta。IPTG诱导后,收集菌液提取蛋白,进行SDS-PAGE分析,结果表明这个BURP家族蛋白编码基因在E.coli中获得了高效表达,该基因在功能启动子的作用下具有表达活性。对该蛋白进行的ESI-Q-TOF分析表明该基因推导出的aa序列与质谱精确测定的aa序列一致。为了了解克隆的大豆GmBURP1蛋白的亚细胞定位性质,将GmBURP1与GFP基因融合,并构建在P1390载体上。利用基因枪介导的方法将P1390-GmBURP1GFP导入洋葱表皮后,观察GFP的发光部位仅在细胞膜上,而作为对照的没有融合BURP基因的载体(P1390-GFP)轰击后细胞质和细胞核中都有荧光,说明GmBURP1蛋白在细胞膜上起作用。