研究目的肝功能衰竭目前仍然是我国常见的临床危重疾病。病情进展快,死亡率极高。肝衰竭的发病机制十分复杂,尤其是慢加急性肝衰竭(ACLF),已有证据表明肝衰竭发生与致病因素、内毒素及机体的免疫损害密切相关。近肝衰竭治疗目前尚无特效疗法,需进一步探索。近年来,干细胞的临床治疗研究逐渐引起人们的关注。其中间充质干细胞(MSC)具有良好的安全性和免疫调节特性,应用于以免疫损害为特点的疾病治疗,获得了令人满意的疗效。本研究在分离出小鼠脐带间充质干细胞(UC-MSC)、建立肝衰竭小鼠模型的基础上,应用UC-MSCs治疗肝衰竭小鼠模型。探索肝衰竭的发病机制及MSC的疗效及机制。研究方法MSCs准备:孕19天C57BL/6小鼠经麻醉处死后,分离出脐带。剪碎后贴壁培养,经过3-4代传代培养,得到纯化的UC-MSC。分化功能鉴定:加入脂化因子、成骨因子进行分化实验,得到脂肪细胞和成骨细胞;细胞表面标志鉴定:经流式细胞仪检测鉴定细胞表面标志;免疫抑制功能鉴定:MSC与激活脾细胞共培养。C57BL/6小鼠慢性肝炎模型准备:C57BL/6小鼠CCL4灌胃3周。处死后检测肝功能、观察肝脏外观后确定模型成功。ALF和ACLF小鼠模型准备:应用D-氨基半乳糖联合脂多糖(LPS)分别经尾静脉注射慢性肝炎小鼠和正常小鼠,分别得到慢加急性肝衰竭(ACLF)模型和急性肝衰竭(ALF)模型。记录两组用药剂量、存活率时间曲线。取出肝脏性病理检查。MSCs对ALF、ACLF模型干预:ALF和ACLF治疗组经尾静脉输注UC-MSCs后,按上述方案重复造模过程。两组对照组为同等ALF和ACLF模型组。在注药5小时后全部取血、取肝脏、取脾脏。血标本经离心分离出血浆后Ficoll分离出单个核细胞,应用流式细胞仪检查各细胞亚群。血浆应用液态芯片法检测小鼠17种细胞因子;肝脏研磨后应用Percoll分离出单个核细胞,计数后,一部分经流式细胞仪检查各细胞亚群,另一部分应用Real time PCR技术检测细胞内各细胞因子m RNA的变化;脾脏研磨后,脾细胞经流式细胞仪检查各细胞亚群。结果分离出的MSCs具有成脂、成骨分化功能,对脾脏淋巴细胞增殖有抑制作用。CCL4小鼠模型肝脏病变符合慢性肝炎特点。ALF、ACLF造模LPS剂量相差极大,ACLF组有内毒素耐受现象;两组小鼠肝功能、肝脏外观及病理均符合肝衰竭特点。ALF、ACLF模型组血浆细胞因子变化与淋巴细胞亚群变化基本一致。ALF组肝脏单个核细胞浸润以枯否细胞、NK细胞等吞噬细胞为主,肝脏坏死与TNF-a相关。ACLF组除枯否细胞外,DC细胞、各淋巴细胞在肝脏内均有分布,且有肝脏内趋化现象,以Th1、Th17、CD8阳性T淋巴细胞为明显。MSC治疗组与对照组相比,ALF、ACLF治疗组存活率均提高。ALF治疗组明显降低TNF-a的水平,ACLF治疗组各致炎性细胞因子均下降,抑炎因子上升。与各淋巴细胞亚群变化基本一致。结论:ALF和ACLF发病机制各有特点,ALF以枯否细胞等固有免疫损害为特点,ACLF以固有免疫损害为基础,获得性免疫损害更明显。MSCs可以调节固有免疫和获得性免疫,能有效抑制肝衰竭,有临床应用前景。