论文部分内容阅读
纤维类物质是地球上数量最大的可再生资源,植物每年通过光合作用产生多达10-50亿吨的纤维类物质。目前大部分纤维类物质未能充分开发利用,造成了巨大的浪费和严重的环境污染。运用微生物对纤维类物质进行充分的酶解作用,可将其转化成糖、酒精或化工原料等,对缓解全球能源危机、食品紧张以及环境污染有着重大意义。本文在黄山生态林腐木筛选出一株纤维素酶产生菌的基础上,对其在分类学上地位、纤维素酶编码基因进行系统分析,并依此构建纤维素酶基因工程菌。主要研究成果如下：1)利用CMC-Na刚果红平板筛选法,从黄山生态林腐木中分离等到一株纤维素酶产生菌,通过原生质体紫外诱变选育获得一株纤维素酶高产菌株,命名为TP-02；其纤维素酶的滤纸酶活及内切葡聚糖苷酶酶活分别达到7.56 IU/mL、28.5IU/mL,其发酵时间与目前研究较多的里氏木霉相比大约提前36h。2)以分子生物学鉴定方法为依据,辅以菌种的形态学鉴定对突变株TP-02进行菌种鉴定。研究结果表明突变株TP-02隶属于接合菌亚门、藻状菌纲、毛霉目、毛霉科、根霉属、匍枝根霉亚种点头根霉(Zygomycotina, Phycomycetes, Mucorales, Mucoraceae, Rhizopus stolonifer var. reflexus)。3)利用匍枝根霉亚种点头根霉TP-02的mRNA模板,在逆转录酶的作用下,以Oligod(T)18引导合成cDNA第一链,同时在GenBank上搜索该菌株近缘属种的内切葡聚糖苷酶基因序列并设计引物,进行PCR扩增,序列经GenBank数据库比对分析为新的内切葡聚糖苷酶编码序列,提交GenBank,获得序列登录号为FJ807269。将扩增产物与原核表达载体pET20b连接构建表达载体pET20b-EG1,并转染大肠杆菌BL21(DE3)。重组菌发酵36h后,经IPTG诱导可达到最大值0.715IU/mL;发酵产物经纯化后,经SDS-PAGE检测,可达到一相对分子量大约为40kDa的目的片段。4)利用匍枝根霉亚种点头根霉TP-02的mRNA模板,在逆转录酶的作用下,以锚定引物Oligo (dT)18 Anchor Primer:5’-(GA)10 CTCGAGCGGCCGC(T)18 V-3’为引导,合成双链全长cDNA,同时加上含有酶切位点的接头,经酶切后与毕赤酵母表达载体pPIC9K相连构建表达质粒,转染毕赤酵母GS115感受态细胞。将所获得cDNA文库利用CMC刚果红平板筛选法,获得阳性单克隆,酶切测序,获得3个不同的序列,经比对分析其中一个序列与已提交的序列同源率达到100%,其余序列同源率较低,可能为新的内切葡聚糖苷酶编码序列,提交GenBank,获得序列登录号分别为HM043656和HM043657；将序列所对应的菌株进行发酵分析,经甲醇诱导培养60h后,其内切葡聚糖苷酶酶活可达到最大值分别为1.15IU/mL、1.86IU/mL以及1.56IU/mL.经SDS-PAGE检测获得相对分子量大约为40kDa、44 kDa、46kDa 3条带对应于序列登录号为FJ807269、HM043656、HM043657.