随着疟原虫对抗疟药和蚊虫对杀虫剂抗性的出现,而且疟原虫抗原的多态性、宿主免疫逃避等原因,致使有效疟疾疫苗的缺乏,至此没有完全有效根治疟疾的措施。抗疟药主要研究不同药物对不同期疟原虫的作用,对于预防药是否、如何影响按蚊抗疟原虫免疫反应并不清楚。我们的前期研究发现,抗疟药物-硝喹能诱导斯氏按蚊对约氏疟原虫的黑化,启动按蚊对疟原虫的免疫反应,从而阻断疟原虫在蚊体内的发育,但是如何识别、诱导的机制不清楚。我们研究的目的是认识抗疟药物(硝喹)既能对疟原虫有杀伤作用,又能诱导按蚊产生对疟原虫的黑化免疫反应,疟原虫终止在蚊体的发育,使按蚊不能发挥作为传播媒介的作用。按蚊黑化包被反应中的识别机制的探讨是目前研究疟原虫—蚊媒相互关系分子机制的一个非常活跃的领域。最近研究表明含硫酯键蛋白( thioester-containing protein,TEP1)能显著地影响冈比亚按蚊的黑化疟原虫的能力,那么TEP分子是否在抗疟药诱导按蚊黑化反应中也有作用、并且发挥关键的识别作用。因此,本课题利用斯氏按蚊—约氏疟原虫模型,从药物干预的角度探讨按蚊是如何识别疟原虫,启动按蚊抗疟原虫的免疫反应。研究结果如下:1、根据果蝇TEP1-4及冈比亚按蚊TEP1分子的保守氨基酸序列比对设计简并引物,成功地克隆了4种斯氏按蚊TEP分子,并分别命名为AsTEP1-4。2、利用Real-time PCR方法研究了AsTEP1-4随按蚊吸血、感染疟原虫、以及抗疟药物诱导条件下的转录变化情况。结果显示AsTEP1在动合子穿过蚊胃上皮细胞的时期(感染24 h)和卵囊形成初期(感染4d和5d)表达上调,以后其表达下降,而抗疟药物-硝喹可以诱导AsTEP1表达上调,并从用药后第3d(感染9d后)开始,AsTEP1的转录显著性高于未用药组的AsTEP1水平。结合抗疟药诱导按蚊黑化疟原虫的观察显示,用药后第3d疟原虫卵囊开始出现黑化,这与抗疟药诱导AsTEP1表达明显上调的时相点一致,表明抗疟药诱导按蚊抗疟原虫黑化反应可能与抗疟药诱导AsTEP1转录上调具有相关性。其它AsTEP cDNAs在以上条件下转录无明显变化,提示AsTEP2-4与按蚊抗疟原虫免疫以及抗疟药物诱导按蚊免疫反应无相关性。3、观察AsTEP1对抗疟药干扰后斯氏按蚊体内约氏疟原虫的识别结合作用。光镜观察发现给药后3d,与对照组相比,用药组卵囊出现明显的黑化现象,卵囊形态各异、皱缩,囊壁与内容物间隙加大,甚至有内容物渗出,沉积的黑色颗粒增多,卵囊颜色渐渐变为灰黑色,最后完全被黑色颗粒或团块物质填充即为完全黑化。共聚焦显微镜观察发现用药组卵囊随黑色颗粒的增多,疟原虫自带的GFP荧光信号逐渐减弱,直至消失;TEP1信号不仅在用药组黑化卵囊表面有显示,而且在黑色颗粒沉积处也有显示。说明AsTEP1可能直接参与了抗疟药诱导按蚊黑化相关成分的募集或者间接地参与激活黑化级联反应。4、通过喂饲抗AsTEP1抗血清,观察与黑化表型相关PO酶的活性变化以及抗疟药诱导按蚊黑化反应的变化情况。结果显示喂饲抗按蚊TEP1的抗血清能使按蚊的PO酶活性以及按蚊的黑化率显著降低,说明抗AsTEP1抗血清进入蚊血淋巴抑制了该分子与疟原虫表面成分或者与下游成分的的结合,从而影响了AsTEP1分子调节的黑化免疫反应。提示AsTEP1与抗疟药诱导按蚊抗疟原虫黑化反应具有相关性。研究结果表明,本课题成功克隆了4种斯氏按蚊TEP cDNA,其中AsTEP1与按蚊感染疟原虫以及抗疟药物诱导按蚊免疫反应相关。进一步分析AsTEP1在抗疟药物-硝喹诱使按蚊黑化反应中的机理:斯氏按蚊是约氏疟原虫的易感蚊种,而硝喹可以影响斯氏按蚊抗约氏疟原虫免疫反应,诱导AsTEP1转录上调,从而改变斯氏按蚊对约氏疟原虫的易感性,使得按蚊免疫系统能够识别疟原虫并引发黑化免疫反应,阻止疟原虫在蚊体内的正常发育。本课题对AsTEP1在抗疟药物诱导按蚊黑化免疫反应中的识别作用的探讨为硝喹启动按蚊抗疟原虫免疫反应提供了理论依据,为现场预防药物的选择提供了重要的信息。这既对发展有效疟疾媒介控制策略和现有药物的更合理使用有意义,又对抗疟药物的设计提供了一条非常有意义的途径。