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【研究背景】肾细胞癌(简称肾癌)是泌尿科常见的肿瘤,近年来每年新发病例数一直显现逐年上升的情形。肾癌的早期症状不明显,诊断时约1/4-1/3病人已发生转移。发生转移的肾癌往往失去手术机会,但发展至此阶段的病人药物治疗效果不佳,因此需要进一步研究肾癌的发生机制,为治疗提供新的方向。CARD10(半胱天冬酶募集结构蛋白10)又叫做CARMA3,已经有研究表明CARD10的表达与肿瘤的发生密切相关,其作用主要是通过激活转录因子NF-κB促进肿瘤进展。然而,此信号通路在肾癌中的是否存在仍不清楚。【研究目的】CARD10是否在肾癌细胞中高表达,抑制CARD10表达是否能抑制肾癌细胞的增殖、侵袭、迁移、上皮间质转化和促进其凋亡,及其能否通过NF-κB信号通路进行调节?【研究方法】1.首先培养ACHN细胞、786-O细胞和HK-2细胞,并提取其总蛋白,使用蛋白免疫印迹法检测CARD10在三种细胞的表达情况。2.然后用sh RNA进行细胞转染肾癌ACHN和786-O细胞,形成不含目的基因(sh GFP)转染的阴性对照组和含目的基因(特异性CARD10sh RNA)转染的实验组细胞,在蛋白分子水平检测其是否转染成功;MTT实验被用来检测细胞的生长活力;流式细胞术被用来检测各个周期细胞分布情况和凋亡细胞所占百分比;Transwell小室被用来检测各组细胞的侵袭和迁移情况;使用蛋白免疫印迹法检测三组细胞上皮间质转化相关蛋白的表达情况。3.最后进行CARD10调节肾癌NF-κB通路的研究,首先验证EGF是否能够激活RCC细胞(ACHN、786-O)中NF-κB通路,使用EGF(10ng/ml)分别处理两种细胞细胞,0min、7.5min、15min、30min;然后探讨CARD10表达的抑制对ACHN和786-O细胞NF-κB信号通路激活的影响,使用EGF(10ng/ml)分别处理转染抑制组和不抑制CARD10表达组细胞,0min、15min、30min;最后,又探讨正常细胞和RCC细胞中NF-κB通路的激活情况,使用EGF(10ng/ml)分别处理ACHN、786-O和HK-2细胞,0min、15min、30min;分别提取以上相关处理后的细胞总蛋白,蛋白免疫印迹法检测NF-κB信号通路相关蛋白的激活情况(IkBα和P-P65)。【研究结果】1.CARD10在肾癌ACHN、786-O细胞表达明显高于HK-2细胞。2.敲低肾癌细胞中CARD10的表达可以抑制其增殖、促进其凋亡。3.敲低肾癌细胞中CARD10的表达可以抑制其侵袭和迁移能力。4.敲低肾癌细胞中CARD10的表达可抑制其上皮-间质转化。5.肾癌细胞中NF-κB通路的活化程度明显高于正常细胞,敲低肾癌细胞CARD10的表达可抑制肾癌细胞中NF-κB通路的的活化。【结论】CARD10在肾癌细胞中高表达,敲低肾癌细胞中CARD10的表达可以通过抑制NF-κB通路的活化,从而抑制肾癌的进展。