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目的:胆汁淤积性肝病(CSLD)是临床上一种较为常见的肝病,是指由肝内肝外各种原因引起的胆汁形成、分泌和排泄障碍,使胆汁不能正常进入肠道而淤积于肝胆系统的病理状态,其病因复杂,发病机制有待深入阐明,尚缺乏足够有效的治疗手段。核受体(nuclear receptors)法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)目前被认为是治疗胆汁淤积的关键靶点。大黄素是中药大黄中的主要活性成分,国内外学者研究证实其具有肝保护作用及抗炎、抗病毒、抑菌、免疫调节、促进胃肠蠕动、抗氧化、清除自由基、改善微循环等诸多药理作用。本研究通过体外及体内实验探讨大黄素通过FXR/BSEP信号通路对胆汁淤积的干预作用,希望为胆汁淤积的的治疗提供新策略。方法:1、培养人肝细胞株LO2,分别设置正常组、UDCA组、DXM组、大黄素低浓度组、大黄素中浓度组、大黄素高浓度组。经大黄素干预后,收集细胞,采用q RT-PCR法测定LO2细胞中FXR/BSEP信号通路相关分子mRNA的表达水平,western-blot法测定LO2细胞中FXR/BSEP信号通路相关分子蛋白的表达水平。2、合成FXR的si RNA序列,用于下调LO2细胞内的FXR分子。经慢病毒载体包被后形成慢病毒Lentivirus-FXR用于上调LO2细胞中的FXR分子的表达,转染48h及72h时使用荧光显微镜观察转染情况,转染72h后,收集细胞,采用q RT-PCR法测定LO2细胞中FXR/BSEP信号转导通路相关分子mRNA的表达水平,western-blot法测定LO2细胞中FXR/BSEP信号转导通路相关分子蛋白的表达水平。3、利用si RNA干扰和慢病毒上调LO2细胞中FXR的表达后,细胞经大黄素干预后,收集细胞,利用q RT-PCR法测定LO2细胞中FXR/BSEP信号转导通路相关分子mRNA的表达水平,western-blot法测定LO2细胞中FXR/BSEP信号转导通路相关分子蛋白的表达水平。4、采用在体胶原酶灌注、不连续密度梯度离心并结合淘洗法分离大鼠肝细胞,采用免疫荧光自激发、角蛋白CK-18免疫荧光法验证肝细胞纯度、台盼蓝拒染实验判断细胞的活力,检测细胞纯度和活力均>95%以上后,得到大鼠原代肝细胞,进行体外培养。原代肝细胞经大黄素干预后,收集细胞,利用q RT-PCR法测定原代肝细胞中FXR/BSEP信号转导通路相关分子mRNA的表达水平,western-blot法测定原代肝细胞中FXR/BSEP信号转导通路相关分子蛋白的表达水平。5、使用ANIT建立SD大鼠胆汁淤积模型,42只大鼠随机分组,分别设置对照组、模型组、UDCA组、DXM组、大黄素低浓度组、大黄素中浓度组、大黄素高浓度组。实验共持续7天,第1至6天每组分别给予生理盐水或相应浓度的各组药物灌胃,除空白组外其余组在实验第5天给予ANIT溶液(1ml/100g)灌胃给药1次造模。第7天实验结束后,收集大鼠血清及肝脏组织。检测大鼠血清中生化指标,利用HE染色法检测肝脏组织病理学变化,采用IHC法检测FXR1、FXR2、BSEP分子在肝脏组织的分布及其表达水平,采用q RT-PCR法检测大鼠肝脏内FXR/BSEP信号转导通路相关分子的mRNA的表达水平,采用western-blot法检测大鼠肝脏内FXR/BSEP信号转导通路相关分子蛋白的表达水平。结果:1、在LO2细胞株中,与对照组相比,大黄素组中BSEP和FXR的mRNA表达显著升高;大黄素组中BSEP,FXR1和FXR2的蛋白表达也显著增加。2、FXR被si RNA下调后,与对照组相比,si RNA组,BSEP,FXR1和FXR2的蛋白表达在FXR-si RNA组中也显著降低。与FXR-si RNA组相比,大黄素组中BSEP和FXR的mRNA表达显著升高。与FXR-si RNA组相比,大黄素组中BSEP,FXR1和FXR2的蛋白表达也显著升高。3、慢病毒转染FXR过表达后,与对照组相比,慢病毒组中BSEP和FXR的mRNA表达显著增加,BSEP,FXR1和FXR2的蛋白表达也显著升高。慢病毒感染组。与慢病毒组相比,大黄素组中BSEP和FXR的mRNA表达显著升高,而大黄素组中BSEP,FXR1和FXR2的蛋白表达也显著升高。4、在大鼠原代肝细胞中,与未处理的细胞相比,与LO2肝细胞细胞系的结果一致。大黄素组显示FXR和BSEP的mRNA水平显著升高。FXR1,FXR2和BSEP的蛋白质表达也显著增加。5、在SD大鼠中,与正常组大鼠相比,模型组大鼠肝脏组织病理学严重改变,模型组BSEP和FXR的mRNA水平显著降低。与模型组比较,大黄素处理对BSEP和FXR的mRNA表达有影响。与对照组相比,模型组BSEP,FXR1和FXR2的蛋白表达显著降低。与模型组相比,大黄素组中BSEP,FXR1和FXR2的蛋白表达显著升高。大黄素对大鼠病理表现,肝组织BSEP等免疫组化有显著影响。结论:1、在人正常肝细胞株LO2和大鼠原代肝细胞中,大黄素可上调FXR/BSEP信号通路相关分子的表达。2、在ANIT建立的SD大鼠胆汁淤积模型中,大黄素可减轻肝脏组织病理学变化,并通过FXR/BSEP信号通路发挥抗胆汁淤积作用。