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目的:1.探究白藜芦醇(resveratrol,RSV)对多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)细胞增殖活力的影响。2.探究RSV能否增敏卡非佐米(carfilzomib,CFZ)对MM细胞的杀伤作用及增敏的可能机制,为CFZ联合RSV应用于MM的治疗提供一定的实验基础。3.探究RSV联合CFZ作用MM细胞后细胞内自噬水平的变化,并且通过抑制自噬途径观察MM细胞凋亡水平的变化,为进一步提高增敏作用提供新的思路。方法:1.MTT法检测RSV对MM细胞增殖活力的影响:以4种MM细胞株LP-1、U266、MM.1S、MM.1R为研究对象,用不同浓度梯度的RSV孵育MM细胞24 h后,采用MTT比色法检测细胞增殖活力的变化。然后用最小抑制浓(minimum inhibitory concentration,MIC)分别处理各细胞株24 h、48 h、72 h后观察细胞增殖活力的变化。2.MTT法检测RSV预处理前后CFZ对MM细胞生长抑制作用的变化:根据方法1的实验结果,选择对RSV最敏感的MM细胞株LP-1为研究对象。将实验分为两组:组1用50μmol/L RSV预处理LP-1细胞24 h后,移除RSV换新的培养基后,再给予不同浓度CFZ处理24 h;组2直接用不同浓度梯度的CFZ孵育LP-1细胞24 h,MTT实验检测CFZ对MM细胞的增殖抑制作用,并分别得出组1与组2的CZF的IC50。3.流式细胞术测周期实验检测细胞周期的变化:将实验分设为四组:对照组、RSV组、CFZ组、RSV+CFZ组。对照组:不给予处理;RSV组:50μmol/L RSV孵育LP-1细胞24 h;CFZ组:40nmol/L CFZ孵育细胞24 h;RSV+CFZ组:50μmol/L RSV预处理LP-1细胞24 h后,移除RSV后并再给予CFZ 40 nmol/L孵育24 h。收集细胞PI染色上流式机检测细胞周期的变化。4.流式细胞术测凋亡实验检测MM细胞凋亡率的变化:同方法3将实验分设为4组,给予不同的处理后收集细胞FITC/PI染色上流式机检测各组细胞凋亡率。5.流式细胞术测活性氧(reactive oxygen species,ROS)实验检测ROS变化:同方法3将实验分设为4组,给予LP-1细胞不同的处理后收集细胞加入荧光探针DCFH-DA,采用流式细胞术检测各组细胞内ROS水平。6.加入活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyl adenine,3-MA)后MM细胞内ROS的变化及凋亡的变化:实验分设为8组,分别为对照组、RSV组、CFZ组、RSV+CFZ组、NAC组、NAC+RSV+CFZ组、3-MA组、3MA+RSV+CFZ组,3 mmol/L NAC预处理LP-1细胞2 h后,1 mmol/L 3-MA预处理LP-1细胞1 h后,再给予方法4、5处理,采用流式细胞术检测各组ROS水平及凋亡率的变化。7.Western bloting实验检测两药联合作用凋亡相关蛋白及自噬相关蛋白LC3I/II的表达水平以及加入3-MA后自噬及凋亡相关蛋白的表达变化;同方法3将实验分为4组,给予不同的处理后收集细胞,采用Western bloting检测细胞周期相关蛋白p38 MAPK、抗凋亡蛋白survivin,Sirt1以及促凋亡蛋白smac、caspase 3的表达水平,同时检测自噬相关蛋白LC3 I/II的表达变化。加入自噬抑制剂3-MA后再给予RSV+CFZ后LC3 I/II及caspase 3的表达变化。8.Smac的小干扰RNA(si RNA)转染细胞后检测凋亡相关蛋白的表达水平:将实验分设为4组:对照组、RSV+CFZ组、si RNA、si RNA+RSV+CFZ组,采用Western bloting检测抗凋亡蛋白survivn,sirt-1以及促凋亡蛋白Smac、的表达水平。9.所有实验数据均采用SPSS17.0统计学软件、Graph Pad Prism 5进行数据分析,采用Graph Pad Prism 5作图,Photoshop对Western blotting进行整理、分析,P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.MTT实验结果得出:RSV对4种MM细胞株LP-1、U266、MM.1S、MM.1R均具有生长抑制作用,并且随着浓度增加,抑制作用逐渐增强(n=3,P<0.05)。以各自MIC分别处理细胞24、48、72 h,随着时间的延长,生长抑制作用逐渐增强(n=3,P<0.05)。CFZ对LP-1细胞具有生长抑制作用,并且随着药物浓度增加,抑制作用增强,IC50-1为8.45±0.76 nmol/L;以RSV预处理后的LP-1细胞为实验对象,给予不同浓度CFZ处理,IC50-2为为6.92±1.78 nmol/L。2流式细胞术测细胞周期结果得出:与对照组相比,RSV组在G0/G1期、S期细胞比例增高,CFZ组、RSV+CFZ组在S期、G2/M期细胞比例增高。与CFZ组相比,RSV+CFZ组在G2/M期细胞比例增高(P<0.01)。3.流式细胞术测凋亡实验得出:对照组、RSV组、CFZ组、RSV+CFZ组凋亡率(%)分别为9.07±2.60、11.63±4.70、42.50±2.31、74.93±5.01;CFZ组、RSV+CFZ组的凋亡率高于对照组、RSV组,且CFZ+RSV组的凋亡率高于CFZ组,差异具有明显统计学意义(P<0.001)。4.流式细胞术测ROS实验得出:RSV组、CFZ组、RSV+CFZ组、3-MA组、3-MA+RSV+CFZ组、NAC组、NAC+RSV+CFZ组ROS水平为对照组的0.98±0.72、1.02±0.72、1.32±0.23、1.18±0.05、1.32±0.16、0.83±0.14、1.14±0.19倍;与对照组相比,RSV+CFZ组、3-MA+RSV+CFZ组ROS水平均升高(P<0.05);与CFZ组相比,RSV+CFZ组ROS水平升高(P<0.05);与RSV+CFZ组相比,NAC+RSV+CFZ组ROS水平降低,3-MA+RSV+CFZ组ROS水平升高,但均未有统计学差异,P值分别为0.128,0.998。5.自噬抑制剂预处理前后RSV+CFZ组凋亡率的变化:对照组、RSV+CFZ组、3-MA组、3-MA+RSV+CFZ组凋亡率(%)分别为10.37±3.41、77.10±2.98、9.63±0.32、90.13±8.24;3-MA+RSV+CFZ组的凋亡率高于CFZ+RSV,差异具有统计学意义(P<0.01)。6 NAC预处理前后RSV+CFZ组凋亡率的变化:对照组、RSV+CFZ组、NAC组、NAC+RSV+CFZ组凋亡率(%)分别为8.03±1.36、69.67±1.59、8.87±0.90、63.70±1.64;RSV+CFZ组、NAC+RSV+CFZ组凋亡率均高于对照组及NAC组(P<0.001);NAC+RSV+CFZ组的凋亡率低于CFZ+RSV组,差异具有统计学意义(P<0.01)。7.WB实验证实RSV+CFZ组p38、smac、caspase 3表达升高,survivin、sirt-1表达减少,以及自噬相关蛋白LC3 I/II表达增高。加入自噬抑制剂后,3-MA+RSV+CFZ组LC3 I/II表达下降,caspase 3剪切体减少。与RSV+CFZ组相比,si RNA+RSV+CFZ组smac、Sirt-1表达水平下降,survivin表达未有明显变化。结论:RSV可增敏CFZ对MM细胞的杀伤作用,主要表现为生长抑制及促凋亡作用增强。首先,生长抑制作用增强可能是ROS/p38MAPK信号通路激活从而使G2/M周期阻滞增强来实现。其次,促凋亡作用可能是通过ROS/sirt-1及smac/survivin两条相互代偿的信号通路发挥作用。此外,两药联合作用产生保护性的自噬现象,阻断自噬可进一步增强RSV联合CFZ的促凋亡作用,因此,RSV、CFZ以及自噬抑制剂的联合应用为MM的临床治疗提供一定的实验基础。