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结核病是严重危害人类健康的疾病之一,其致病菌是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Tb)。由于耐多药(multi drug resistant, MDR)甚至是广泛耐药(extensive drug resistant, XDR)结核杆菌的出现,许多一线甚至一些二线抗结核药物都无法有效治疗结核病,因此寻找新的抗结核药物已迫在眉睫。分枝杆菌的特殊细胞壁结构,对其生存和繁殖极为重要,其核心结构由肽聚糖、聚阿拉伯半乳糖和分枝菌酸组成。其中聚阿拉伯半乳糖与肽聚糖之间靠L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺双糖衔接分子连接。该双糖衔接分子中的L-鼠李糖是细菌特有的,人体内不存在,可作为理想且安全的新型抗结核药的靶标。dTDP-鼠李糖为鼠李糖残基供体, RmlA-D四种酶参与dTDP-鼠李糖的生物合成过程,其中rmlA基因编码的D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶(RmlA)催化第一步反应,即葡萄糖-1-磷酸和dTTP在RmlA的催化下生成dTDP-葡萄糖。结核分枝杆菌的rmlA-D基因存在于基因组的不同位置,其中rmlA基因单独存在, rmlB和rmlC基因位于一个操纵子内, rmlD基因与编码鼠李糖基转移酶(WbbL)的wbbL基因及manB基因组成一个操纵子。在本课题组以前的工作中,我们研究并证明了rmlB,C,D基因是分枝杆菌生长必需基因,还建立了结核分枝杆菌RmlB-D的酶活性检测方法,这些研究结果为筛选上述酶的抑制剂,从而发现新的抗结核药物提供了基础。本论文以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Sm) mc2155菌株作为实验模式菌,用同源重组方法建立mc2155 rmlA基因敲除菌株。通过测定rmlA基因敲除菌株的生长曲线,确定rmlA基因是否为分枝杆菌生长必需基因。在此基础上,研究RmlA酶缺乏时rmlA基因敲除菌株细胞形态的改变,和在缺乏RmlA酶的情况下rmlA基因敲除菌株蛋白质谱的变化。研究结果将为参与dTDP-鼠李糖合成的D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶作为研发抗结核新药的靶标提供更有力的证据。本文获得以下结果:1.条件性复制质粒pPR27-xylE-Sm rmlA::KanR的构建:根据Tb RmlA的氨基酸序列,对TIGR的耻垢分枝杆菌mc2155菌株基因组数据库进行BLAST分析,获得mc2155的rmlA和启动子(上游约500 bp)序列。从mc2155基因组中PCR扩增该基因及其启动子序列,克隆到pMD18-T克隆质粒,用BcaBEST Primer M13-47、RV-M对质粒上携带的Sm rmlA基因及其启动子序列进行DNA测序,并与已知的Sm rmlA基因及其启动子序列进行比对,结果表明PCR扩增的是正确的Sm rmlA基因。用BamHI酶切pUC4K质粒获得Kan抗性基因(KanR) ,用Klenow补平KanR基因的两端并克隆到pMD18-Sm rmlA质粒中Sm rmlA上的StuI位点,产生Sm rmlA::KanR突变基因。再将Sm rmlA::KanR突变基因克隆到pPR27-xylE质粒,构建出条件性复制质粒pPR27-xylE-Sm rmlA::KanR。pPR27-xylE携带温度敏感型复制子,使质粒在允许温度(30°C)条件下可以复制,在非允许温度(42°C)条件下不能复制。pPR27-xylE还携带xylE基因和负选择标记sacB基因。2.营救质粒pCG76-Tb rmlA的构建:从结核分枝杆菌H37Rv基因组中PCR扩增Tb rmlA基因,克隆到pMD18-T克隆质粒,测序与比对结果表明PCR扩增的是正确的Tb rmlA基因。用NdeI和XhoI酶切质粒pMD18-Tb rmlA,获得Tb rmlA基因,克隆到pET23b-Phsp60质粒的相应位点,构建出pET23b-Phsp60-Tb rmlA质粒。再经XhoI酶切、Klenow补平和XbaI酶切获得Phsp60-Tb rmlA片段。其中的Phsp60是来源于分枝杆菌BCG热休克蛋白60的启动子。将Phsp60-Tb rmlA克隆到pCG76质粒,构建出pCG76-Tb rmlA营救质粒。由于pCG76不携带用于目的基因表达的启动子,目的基因Tb rmlA的表达由Phsp60启动子所控制。此外,pCG76质粒也携带温度敏感型复制子,使质粒在30°C条件下可以复制,在42°C条件下不能复制。因此,可以通过调节温度使pCG76-Tb rmlA营救质补偿或不补偿mc2155 Sm rmlA基因敲除菌株中Sm rmlA::KanR突变基因的功能。3.第一次同源重组突变菌株mc~2155 M-1的筛选:将条件复制性质粒pPR27-xylE-Sm rmlA::KanR电转化到mc2155感受态细胞中,由于pPR27-xylE-Sm rmlA::KanR在42oC不能复制,Sm rmlA::KanR与mc2155基因组中的Sm rmlA发生同源重组,使Sm rmlA::KanR以及sacB基因和xylE基因整合到mc2155基因组中。用Sm rmlA探针对SmaI酶切的7个黄色菌落基因组DNA进行Southern杂交分析,结果显示发生第一次同源重组的mc2155 M-1突变菌株具有预期的杂交条带(3.24 kb,7.72 kb和8.07 kb)。4.第二次同源重组突变菌株mc2155 M-2 (Sm rmlA基因敲除)的筛选:将pCG76-Tb rmlA营救质粒电转化到mc2155 M-1感受态细胞中,用含10%蔗糖的选择性LB琼脂培养基,在30°C培养转化的mc2155 M-1,由于条件复制质粒的sacB基因和xylE基因也被整合到mc2155 M-1基因组中,sacB基因的表达产物Levansucrase水解蔗糖,产生有害细菌生长的物质,引起mc2155 M-1死亡,所以在这种选择压力下,mc2155 M-1基因组中的Sm rmlA::KanR与Sm rmlA发生第二次同源重组,将Sm rmlA基因、scaB基因以及xylE基因从mc2155 M-1基因组中删除并被核酸酶水解,基因组中只存在Sm rmlA::KanR。如果Sm rmlA为分枝杆菌生长必需基因,营救质粒上的Tb rmlA基因必须在mc2155 M-2突变菌株中表达出Tb RmlA蛋白质以补偿Sm rmlA::KanR的功能。用Southern印迹方法筛选出mc2155 M-2突变菌株,即Sm rmlA基因敲除菌株。5.生长曲线的测定测定mc2155 M-2突变菌株在30°C和42°C的生长曲线,结果发现该突变菌株在30°C可以生长,但在42°C不生长,说明rmlA基因是分枝杆菌生长必需基因。在随后的温度转换实验中,让mc2155 M-2突变菌株在营救质粒容许的30°C生长20小时,使之表达一定量Tb RmlA蛋白后,提高温度至42°C,使pCG76-Tb rmlA不能复制,影响Tb RmlA蛋白的表达。在Tb RmlA逐渐缺乏的情况下,测定mc2155 M-2突变菌株的生长曲线。结果显示mc2155 M-2突变菌株可以在42°C继续增殖1-2天,第三天以后逐渐有细菌死亡,菌量减少。进一步说明了rmlA基因是分枝杆菌生长必需基因。6. RmlA缺乏对突变菌株mc2155 M-2细胞形态的影响在温度转换实验中,取mc2155 M-2突变菌株细胞用扫描电镜观察其细胞形态。结果显示在30°C条件下,该mc~2155 M-2突变菌株均呈短棒状、轮廓饱满、表面光滑的形态。与野生型对照无明显差异。但在42°C条件下,营救质粒Tb rmlA表达受影响致使RmlA蛋白缺乏时,第三天菌体表面出现明显的塌陷和皱褶,第六天甚至出现大量破碎样物质,菌体轮廓亦不清晰,似乎都粘连在一起,部分细菌发生裂解。说明RmlA蛋白缺乏对细胞壁完整性有影响,可导致细胞裂解。7. RmlA缺乏对突变菌株mc~2155 M-2蛋白质谱的影响在温度转换以后,收获在42°C生长5天的mc2155 M-2细菌细胞提取胞浆蛋白,进行双向凝胶电泳,初步发现mc2155 M-2的蛋白质谱有所变化。与对照相比,rmlA基因敲除以后蛋白质点变少,由于RmlA的缺乏可能导致许多与胞壁代谢有关蛋白的降低,需要进一步确认这些点。结论:本研究以耻垢分枝杆菌mc~2155菌株作为实验模式菌证明rmlA基因与分枝杆菌生长的相关性。我们构建了携带Sm rmlA::KanR突变基因的条件复制质粒并转化mc~2155,用Southern印记方法筛选出发生第一次同源重组的mc~2155 M-1突变菌株。又构建了携带Tb rmlA基因的营救质粒pCG76-Tb rmlA,并转化mc~2155 M-1,当Tb rmlA基因表达时, mc~2155 M-1基因组中的Sm rmlA::KanR突变基因与Sm rmlA基因发生第二次同源重组,用Southern印记方法筛选出发生第二次同源重组的mc~2155 M-2突变菌株,即Sm rmlA基因敲除菌株。根据Sm rmlA基因敲除菌株在30°C和42°C条件下的生长曲线,以及在缺乏Tb RmlA蛋白条件下Sm rmlA基因敲除菌株细胞形态的改变和蛋白质谱的变化,我们证实了编码结核分枝杆菌D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶(RmlA)的rmlA基因是分枝杆菌生长所必需的基因。缺乏RmlA蛋白使细菌胞壁成分合成受阻,导致细菌裂解死亡。在缺乏RmlA蛋白时,细菌蛋白质谱也发生了改变。我们将进一步对这些蛋白质进行鉴定,以发现更多的药物作用靶点。本研究结果为参与dTDP-鼠李糖合成的D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶作为研发抗结核新药的理想靶标提供更有力的证据,以便用D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶促反应筛选酶抑制剂,发现先导化合物。未来研究方向:1.重复和优化双向电泳条件,并根据双向电泳结果,对感兴趣的蛋白质差异点用胰蛋白酶进行酶解,然后用质谱方法获得肽质谱并与数据库比对,以发现更多的靶点。然后进一步采用分子生物学的方法,克隆这些差异蛋白的基因,鉴定其功能,以期发现rmlA基因与其它基因之间是否存在相互调控相互影响的关系。2.用高效液相色谱(HPLC)方法分析Sm rmlA基因敲除菌株与野生型mc2155菌株之间细胞壁聚糖(聚阿拉伯半乳糖)结构的差异;用气相色谱(GC)分析二者糖组成的差别;3.通过RmlA酶活性检测方法的建立,筛选和优化有该酶抑制活性的先导化合物,以期寻找到新型抗结核药物。在此基础上,用本文构建的rmlA基因敲除细胞模型进一步鉴定该化合物。