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背景胰腺癌是世界范围内癌症导致死亡的主要原因之一。早期诊断困难,复发率高,生存率低是胰腺癌的主要特点。即使术后辅助化疗,胰腺癌患者的生存率仍未明显改善。目前研究发现自噬与癌症密切相关,将自噬抑制与其他传统治疗方法(化疗或放疗)在不同肿瘤类型、不同分期的最佳结合,可以成为提高抗癌治疗效果的成功途径。MiRNAs可能在自噬发生过程中发挥作用,但他们之间的复杂关系及作用机制尚不明确。本研究前期实验发现氯喹作为自噬抑制剂处理胰腺癌细胞后,miR-154-3p表达下调,ERBB4表达上调,miR-154-3p与ERBB4存在潜在靶向关系。本研究旨在探索氯喹自噬抑制剂及miR-154-3p对胰腺癌的影响,为寻求治疗胰腺癌的方法提供新思路。材料与方法1.从广西医科大学第一附属医院病理科收集76例胰腺癌石蜡样本组织及39例胰腺癌癌旁石蜡样本组织,运用实时定量逆转录聚合酶链反应(RTqPCR)的方法检测石蜡组织中miR-154-3p、ERBB4及自噬相关基因ATG5、LC3B、p62的表达;筛选GEO、TCGA、ArrayExpress、Oncomine等公共数据库的数据后进行整合分析miR-154-3p、ERBB4及自噬相关基因在胰腺癌组织中的表达。此外,还运用免疫组化方法检测ERBB4蛋白在胰腺癌及癌旁组织中的表达。2.采用RT-qPCR的方法检测Panc-1、SW1990胰腺癌细胞系中miR-154-3p、ERBB4及自噬相关基因的表达,再检测使用氯喹(chloroquine,CQ)处理胰腺癌细胞后miR-154-3p、ERBB4及自噬相关基因的表达,验证前期实验的芯片结果;采用免疫印迹(Western blot,WB)的方法检测CQ处理胰腺癌细胞后ERBB4及自噬相关基因的表达;同时进行CCK-8细胞增殖、细胞划痕、细胞凋亡实验检测CQ对细胞增殖、迁移及凋亡的影响。3.细胞划痕实验、transwell小室迁移及侵袭实验检测miR-154-3p对胰腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。双荧光素酶报告实验验证miR-154-3p与ERBB4的靶向关系;RT-qPCR检测抑制及过表达miR-154-3p后,ERBB4的表达变化。结果1.MiR-154-3p/ERBB4与自噬相关基因在胰腺癌中的表达及意义MiR-154-3p在胰腺癌蜡块组织中平均表达水平高于癌旁组织,ERBB4在胰腺癌蜡块组织中平均表达水平低于癌旁组织,自噬相关基因ATG5、LC3B在胰腺癌蜡块组织中具有高表达趋势,p62在胰腺癌蜡块组织中具有低表达趋势,但表达差异均不具有统计学意义。整合GEO、TCGA、ArrayExpress、Oncomine及本研究RT-qPCR的数据进行荟萃分析,发现miR-154-3p表达差异不具有统计学意义;ERBB4的表达下调,自噬相关基因ATG5、LC3B和p62的表达上调,差异均具有统计学意义。值得注意的是在GSE60980基因芯片中,miR-154-3p在胰腺癌组织中高表达,ERBB4为低表达,并且二者ROC曲线下面积大于70%。免疫组化结果显示,ERBB4蛋白在胰腺癌组织中既有阴性表达又有阳性表达,差异不具统计学意义。2.氯喹对胰腺癌细胞miR-154-3p/ERBB4和自噬相关基因表达及细胞增殖、迁移的影响MiR-154-3p在Panc-1细胞系中高表达,而ERBB4为低表达,ATG5、LC3B均为高表达,p62为低表达,差异均具有统计学意义。CQ处理胰腺癌细胞后RT-qPCR检测miR-154-3p以及ERBB4的表达变化,发现与前期芯片结果一致,即miR-154-3p表达下调,ERBB4表达上调;本研究还发现ATG5、LC3B、p62均表达下调。在WB的检测中,CQ处理后ERBB4蛋白水平同样地表达升高;同时,LC3B的蛋白表达水平降低,而p62蛋白的表达水平升高。除此之外,加入CQ自噬抑制剂处理胰腺癌细胞后,细胞增殖、迁移能力明显降低,凋亡率升高。3.MiR-154-3p对胰腺癌细胞迁移、侵袭的影响及与ERBB4靶向调控关系的验证抑制miR-154-3p表达后,细胞划痕实验、transwell小室迁移及侵袭实验显示胰腺癌细胞系Panc-1的迁移和侵袭能力受到抑制。双荧光素酶报告显示,miR-154-3p与ERBB4存在直接靶向关系。在胰腺癌细胞系Panc-1中抑制miR-154-3p表达后,ERBB4表达升高;过表达miR-154-3p后,ERBB4表达降低。结论CQ在胰腺癌中可能发挥抑癌的作用,MiR-154-3p在胰腺癌中可能发挥促癌作用,CQ可能通过miR-154-3p靶向ERBB4在胰腺癌中发挥抑癌作用。