背景:乳腺癌发病率居女性恶性肿瘤之首,约70%的乳腺癌雌激素受体（estrogen receptor,ER）/孕激素受体（progestron receptor,PR）表达阳性。他莫昔芬（Tamoxifen,TAM）因其经济、毒性小、药效持久至今仍是治疗ER+/PR+乳腺癌患者综合治疗的一线药物。临床使用已30余年,可减少乳腺癌年死亡率31%,然而仍约有30%～50%患者由于TAM耐药而出现复发和转移,故揭示他莫昔芬耐药机制仍是当今乳腺癌研究具有挑战性的热点。耐药是癌细胞固有的和在治疗下不断选择进化的过程。进化的核心是肿瘤内异质性,在肿瘤的异质细胞群中,肿瘤干细胞（Cancer stem cells,CSCs）不是静态细胞群,是在治疗后不断自我更新成为更具有侵袭性的不断变化的细胞群,是驱动癌症进展的功能性细胞群,随着耐药性的产生其数量也随之增多。乳腺癌干样细胞常具有CD44+/CD24-/ER-表型,具有上皮间充质转换（EMT）特性及ALDH升高的高度侵袭特点。众多研究支持乳腺癌干细胞（Breast Cancer stem cells,BCSCs）是ER+乳腺癌获得TAM耐药的驱动细胞,在他莫昔芬耐药发挥中轴平台作用,然而,干细胞并非是静止不变的实体细胞群,由于干细胞与非干细胞处于分化和去分化的动态变化,使得肿瘤干细胞很难作为特殊的靶标,阻断肿瘤干细胞和非干细胞的转化是我们需要努力的方向。研究表明,肿瘤微环境中外泌体串扰可以调控乳腺癌干细胞稳态。外泌体（Exosomes,EXO）是一种直径约30～150nm的分泌囊泡,其来源于细胞内的囊泡系统,许多细胞都可以分泌,其内含有大量microRNA和蛋白,是细胞之间发生物质交换、信息交流的重要载体。外泌体被认为是肿瘤微环境中一种新的复杂的细胞通讯机制,可以作为转录因子和核酸的载体,诱导受体细胞的表观遗传变化。有研究显示乳腺癌他莫西芬耐药细胞株的耐药信息可以通过外泌体向敏感细胞株传递。由于肿瘤细胞的外泌体可能存在于患者的体液中,因此研究它们的功能和分子作用机制非常重要。有研究表明,外泌体的运输是双向的,人肿瘤细胞与间充质干细胞（MSCs）之间的相互作用涉及到外泌体的交换,肿瘤细胞可以改变MSCs-EXO的含量和特点,反之,MSCs也可以改变肿瘤细胞来源的外泌体所携带的信息。肿瘤细胞释放的外泌体,能够调节细胞增殖、凋亡、侵袭和上皮-间充质转化,抑制免疫细胞活性,促进血管生成,形成更适宜肿瘤生存的微环境。另一方面,来源于基质细胞（如间充质干细胞）的外泌体可能通过其携带的转录因子和核酸的相互串扰而影响肿瘤细胞的表型,调控肿瘤干细胞的稳态。MSCs作为肿瘤微环境中的主要成份,其中以骨髓组织中间充质干细胞含量最为丰富（BMMSCs）,BMMSCs来源的外泌体（BMMSCs-EXO）可以改变肿瘤细胞的细胞功能,从而改变肿瘤微环境和增加肿瘤异质性。由于内外微环境的改变,BMMSCs-EXO与乳腺癌细胞来源的外泌体（BCCs-EXO）交互作用,可以促进肿瘤细胞中非干细胞向干细胞的转化,从而促进肿瘤的发生。因此,研究BCCs-EXO与BMMSCs-EXO间的相互串扰作用在乳腺癌耐药中的影响将为耐药性乳腺癌的治疗提供新的靶点。中医学认为肝郁气滞、冲任失调是导致乳腺癌的主要因素之一,也是肿瘤治疗出现耐药的重要因素。近年来,中药在逆转乳腺癌耐药方面有显著效果,疏肝益肾方由逍遥散合理冲汤加减而成,具有疏肝益肾,调理冲任之血的功能,攻补兼施,做到祛邪而不伤正。我们课题组前期研究发现TAM耐药细胞株MCF7/LCC9较敏感细胞株MCF7有较强的增殖活性,且疏肝益肾方对MCF7/LCC9有抑制作用,通过抑制TAM多个耐药信号从而逆转耐药。本研究将从“微环境-乳腺癌干细胞-外泌体”角度进一步探究乳腺癌TAM耐药机制及疏肝益肾方对其的调控,为“疏肝益肾方”的临床应用提供新的科学依据。目的:1.通过观察外泌体串扰对乳腺癌耐药细胞MCF-7/LCC9的增殖,凋亡,迁移等的影响,明确疏肝益肾方可以通过调控BMMSCs-EXO和BCCs-EXO串扰,从而影响细胞的生物学特性。2.通过观察外泌体串扰对乳腺癌耐药细胞MCF-7/LCC9的成球能力及相关蛋白表达的影响明确疏肝益肾方可以通过调控BMMSCs-EXO和BCCs-EXO串扰影响耐药细胞干性,减少乳腺癌非干细胞向干细胞转化而逆转他莫昔芬耐药。方法:1.制备四组大鼠含药血清作为干预方式,分别为对照组、TAM组、SGYS组、TAM+SGYS联合组。2.应用超速离心法分别提取MCF-7/LCC9细胞来源的外泌体MCF-7/LCC9-EXO和BMMSCs细胞来源的外泌体BMMSCs-EXO。3.应用透射电子显微镜（TEM）观察外泌体形态与数量、纳米粒子追踪技术（NTA）检测外泌体浓度与粒径、Western blot检测外泌体标志蛋白CD9、CD63和TSG101对外泌体进行鉴定。4.应用荧光显微镜观察BMMSCs对MCF-7/LCC9-EXO的摄取情况以及MCF-7/LCC9细胞对BMMSCs-EXO的摄取情况。5.应用CCK8法检测四种含药血清干预下的外泌体串扰对MCF-7/LCC9细胞增殖活性的影响。6.应用流式细胞仪检测四种含药血清干预下的外泌体串扰对MCF-7/LCC9细胞凋亡的影响。7.应用Transwell法检测四种含药血清干预下的外泌体串扰对MCF-7/LCC9细胞迁移的影响。8.应用成球实验检测四种含药血清干预下的外泌体串扰对MCF-7/LCC9细胞干性的影响。9.应用Western blot检测四组含药血清干预的外泌体串扰对MCF-7/LCC9细胞中肿瘤干细胞标志物CD24、CD44蛋白的表达及耐药相关蛋白HER2、ERα表达量的影响。10.应用ImageJ软件进行数据采集,利用GraphPad Prism 8软件对实验数据进行统计分析,实验结果以“x±s”表示,单因素两组间差异统计采用非配对T-test进行比较分析,多组间差异统计采用One-way ANOVA进行比较分析。结果:1.电镜结果显示MCF7/LCC9-EXO与BMMSCs-EXO均呈囊泡状有完整的茶托结构,具有外泌体典型特征,且直径均在30～150nm之间。2.粒径结果显示MCF7/LCC9-EXO与BMMSCs-EXO均在外泌体直径范围内。3.Western blot 结果显示 CD9、CD63 和 TSG101 在 MCF7/LCC9-EXO 与BMMSCs-EXO中均呈阳性表达。4.荧光显微镜观察到MCF-7/LCC9-EXO可以被BMMSCs成功摄取,且BMMSCs-EXO可以被MCF-7/LCC9细胞成功摄取。5.疏肝益肾方对乳腺癌耐药细胞MCF-7/LCC9的生物学特性的影响:（1）CCK-8检测细胞增殖结果显示,TAM组、SGYS组和联合组的细胞增殖能力在各时间段较对照组均显著降低（P<0.001）,联合组降低最明显,其次为SGYS组、TAM组;与TAM组相比,SGYS组和联合组的细胞增殖能力在各时间段均显著降低（P<0.001）,联合组较SGYS组降低更明显,差异有统计学意义（P<0.01）。结果表明,疏肝益肾方可以通过干预外泌体串扰抑制MCF-7/LCC9细胞增殖,且可以与TAM产生协同作用,起到逆转TAM耐药性的作用。（2）流式细胞仪检测凋亡结果显示,实验组的细胞凋亡水平较对照组显著升高,差异均有统计学意义（P<0.001）;与TAM组相比,SGYS组和联合组的细胞凋亡水平也显著升高（P<0.001）。结果表明,疏肝益肾方可以通过干预外泌体串扰促进MCF-7/LCC9细胞凋亡,与TAM联用一定程度上增强了 TAM对耐药株MCF-7/LCC9的抗肿瘤作用。（3）Transwell迁移实验结果显示,与对照组相比,TAM组、SGYS组与联合组的细胞迁移的数量较少,差异有统计学意义（P<0.05）,且SGYS组与联合组的细胞迁移数显著低于TAM组（P<0.001）。结果说明SGYS中药组的含药血清对细胞迁移的抑制作用较明显,而TAM含药血清组对细胞的迁移抑制作用弱,效果不明显,联合疏肝益肾方后较单药组进一步增强对MCF-7/LCC9细胞迁移的抑制。（4）成球实验结果显示,与对照组相比,TAM组、SGYS组与联合组的细胞成球数量减少,且具有统计学差异（P<0.001）,且SGYS组与联合组的细胞成球数显著低于TAM组（P<0.001）。结果表明SGYS中药组会明显抑制MCF-7/LCC9细胞的成球能力,降低细胞的干性,且可以协同TAM进一步抑制细胞的成球能力,一定程度上增强了耐药株MCF-7/LCC9对TAM的敏感性。（5）Western blot结果显示,与对照组相比,TAM组的CD24、CD44、HER2与ERα的变化均无统计学差异（P>0.05）;SGYS组与联合组的ERα和CD24表达量均显著上调（P<0.01）,HER2和CD44的表达量均显著下调（P<0.001）,且联合组对蛋白表达量的影响均优于单药组（P<0.01）。结果表明,疏肝益肾方可以升高TAM耐药细胞株MCF-7/LCC9中ERα和CD24的表达,同时降低HER2和CD44的表达,联合TAM会增强TAM对耐药细胞中与耐药和干性相关蛋白表达的影响。结论:1.疏肝益肾方通过干预BMMSCs-EXO与BCCs-EXO串扰,可以抑制乳腺癌他莫昔芬耐药株MCF-7/LCC9细胞的生长,促进细胞凋亡,减少细胞迁移;2.疏肝益肾方与他莫昔芬联合使用,具有协同增强作用;3.疏肝益肾方可以通过调控BMMSCs-EXO和BCCs-EXO串扰降低耐药细胞干性,上调细胞中ERα和CD24蛋白的表达,同时降低HER2和CD44的表达,从而在一定程度上减少乳腺癌非干细胞向干细胞转化而逆转他莫昔芬耐药。