食管癌是一种常见的消化道恶性肿瘤。世界卫生组织在2012年的报告显示,全球新增食管癌患者人数达455,800人,其中中国占49%。在中国,食管癌是第二大常见癌症,其死亡率居所有癌症的第四位。食管癌主要有两种亚型:食管鳞癌(ESCC)和食管腺癌(EAC)。ESCC和EAC的分布具有明显的地理差异。在美国,超过80%的食管癌患者是食管腺癌;但在亚非国家,食管鳞癌占据主导地位,比如在中国,约占食管癌的90%。尽管目前已有较多诊断食管鳞癌的生物标记物,但因其缺乏足够敏感度和高特异性,还是无法达到临床要求。因此,寻找新的生物标记物或者关联多个生物标记物来提高灵敏度和特异性,对于食管鳞癌的诊断具有非常重要的意义。MicroRNAs是一类内源性的、长度大约为18-25nt的保守短链非编码RNA,在癌症发生过程中起着重要作用。研究发现,miRNA可以作为预示癌症发生的标记物。单一mi RNA作为标志物的敏感性和特异性都较低,而基于多个miRNA构建生物标志物组合可以较好地提高诊断效能。我们基于TCGA数据库中食管癌的microRNA-seq数据,整合分析后,得到每个样本中每个成熟miRNA的数据,然后采用两项标准初步筛选:丰度至少高于500 reads/millon;case-control的P值(Wilcoxon符号秩和检验)小于0.05,利用完全匹配数据筛选出显著差异表达的miRNA,再利用随机森林算法的重要性排序,筛选最终候选miRNA。结果筛选出9个显著差异表达的miRNA:miR-93-5p、mi R-21-3p、miR-30d-5p、miR-25-3p、miR-30e-3p、mi R-21-5p、miR-181a-5p、miR-29c-3p和miR-103a-3p。结合已有文献报道,我们把这9个mi RNA列为候选miRNA,利用qRT-PCR在93对汉族人群食管鳞癌组织中检测这9个miRNA的表达量。结果显示仅有miR-30e-3p、miR-21-3p和miR-21-5p的表达存在显著性差异,miR-30e-3p在食管鳞癌组表达低于癌旁组,miR-21-3p和miR-21-5p在食管鳞癌组表达高于癌旁组。通过logistic回归对联合3个miRNA诊断食管鳞癌的敏感度和特异性进行了评估,结果显示敏感度为0.62,特异性为0.91,ROC曲线下面积(AUC)为0.80,表明该诊断体系具有诊断效果。研究表明,DNA甲基化也可以作为诊断食管鳞癌的生物标记物。为进一步提高食管鳞癌的诊断效果,在联合上述3个miRNA作为ESCC诊断标记物的基础上,我们同时对食管鳞癌和癌旁组织的DNA甲基化修饰情况进行比较。结合TCGA数据库中食管癌甲基化芯片数据和已有的文献报道,我们分析得到ELMO1,KCNA3,KCNA6和TLX2基因在食管癌中会发生高甲基化。在94对中国人群食管鳞癌组织中对这四个基因的目的序列进行亚硫酸氢盐测序,并利用Bsseeker2软件对甲基化测序数据进行分析,再采用Wilcoxon符号秩和检验对食管鳞癌和癌旁组织的甲基化水平进行了差异分析,结果表明在食管鳞癌组织中,KCNA3、KCNA6和TLX2基因甲基化程度显著高于癌旁组织,提示这三个基因可以作为分子标记物诊断食管鳞癌。通过logistic回归计算联合这三个基因对食管鳞癌的诊断效能,结果显示诊断的敏感度为0.79,特异性为0.84,ROC曲线下面积(AUC)为0.84。基于关联多个不同类型分子标记物提高诊断效率的策略,我们将miRNA诊断体系和基因甲基化诊断体系再次联合,ROC曲线分析显示6个分子标记物联合诊断食管鳞癌的敏感度为0.86,特异性为0.87,AUC的值达到0.90,明显提高了诊断的精确性。在上述3个差异甲基化的基因中,TLX2基因在食管鳞癌和癌旁组织中的甲基化差异最为显著,并且其功能在食管鳞癌中还未有研究,因此,我们将TLX2列为候选研究基因。首先通过qRT-PCR检测在50对中国人群食管鳞癌和癌旁组织中TLX2的表达水平,结果表明,在食管鳞癌组织中TLX2的表达水平显著低于癌旁组织。我们推测很有可能是因为TLX2基因高甲基化修饰导致mRNA水平的降低。使用去甲基化药物5-氮杂胞嘧啶(5-AZA)处理食管鳞癌细胞Ec-109和CaEs-17,结果TLX2的表达水平显著上升,进一步证明TLX2基因是受到甲基化调控的。双荧光素酶报告基因检测系统的结果显示,TLX2基因启动子区高甲基化会导致基因表达水平的降低。在食管鳞癌细胞系中过表达TLX2,细胞增殖受到抑制。这些结果都表明在食管鳞癌中TLX2的表达水平受到启动子区甲基化的调控,其在食管鳞癌的发生进程中起着重要的作用。综上,本研究建立了联合3个miRNA和3个基因甲基化作为诊断食管鳞癌的方法,确定了miR-30e-3p、miR-21-3p、mi R-21-5p和KCNA3,KCNA6,TXL2这6个分子标记物,该诊断体系将有可能辅助临床诊断食管鳞癌。另外,研究表明在食管鳞癌细胞中TLX2基因的表达水平受甲基化调控,其能够抑制食管鳞癌细胞的增殖,这为探究基因甲基化在食管鳞癌发生发展中的分子生物学机制奠定了基础。