嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是导致淡水养殖动物细菌性败血症的主要病原菌,因发病周期长、致死率高,给水产养殖业造成巨大的经济损失。目前,使用抗生素等药物仍然是水产养殖过程中进行细菌性败血症防治的主要手段。但抗生素不仅会使病原菌产生耐药性并且在杀灭病原菌的同时也会杀灭有益菌,导致水体和动物肠道内微生态系统紊乱,加大了疾病防治的难度。同时抗生素的残留也带来了水产品和环境安全问题。近年来,使用拮抗菌等有益微生物来代替抗生素等药物进行疾病防治已成为热点问题。拮抗作用是微生物之间普遍存在的一种自然现象,是指在同一生态位中的微生物之间所发生的生长抑制现象。拮抗菌就是利用微生物间的这种拮抗作用,抑制或者杀死病原菌达到疾病防治的目的。目前,我国水产拮抗菌主要来源于陆生动物,而水产动物肠道中能够定植的土著微生物没有很好地利用开发。所以从水产动物肠道中筛选内源性的拮抗菌,开发水产专用的微生态制剂势在必行。本研究从健康草鱼肠道中筛选出1株对嗜水气单胞菌有较好抑制作用的微生物。进一步研究了该拮抗菌在草鱼肠道中的定植能力和在体抗病效果,并且对拮抗菌的代谢产物进行了分离分析。取得结果如下:1.拮抗嗜水气单胞菌微生物的分离、鉴定:采用平板径向扩散法,从健康草鱼肠道中筛选出1株对嗜水气单胞菌有较好抑制作用的拮抗菌J-1,抑菌圈直径达到9 mm,该拮抗菌对草鱼无致病性,经形态学、生理生化试验和16S rRNA基因序列比对,鉴定该拮抗菌为变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)。2.拮抗菌的定植能力研究:用平板培养法研究拮抗菌J-1在草鱼(20±2 g)肠道中的定植能力,草鱼饲喂含拮抗菌J-1的饵料6 d后饲喂普通饵料,停止饲喂拮抗菌J-1后14 d内草鱼肠道中拮抗菌J-1仍保持在10~7 CFU/尾左右,显著高于对照组(P<0.05)。进一步用抗生素处理草鱼水花培育动物模型来验证拮抗菌J-1的定植能力,草鱼水花饲喂含拮抗菌J-1的蛋黄6 d后饲喂无菌蛋黄,停止饲喂拮抗菌J-1后在其肠道内一直保持较高数量,第18天拮抗菌的数量约为10~5 CFU/尾,而大肠杆菌数量下降很快,第8天草鱼肠道中大肠杆菌的数量下降到约10~2 CFU/尾。3.拮抗菌在体抗病效果研究:对拮抗菌J-1进行在体抗病效果研究,发现拮抗菌J-1通过饵料添加方式饲喂草鱼后保护率达到45.4%。检测草鱼肠道中嗜水气单胞菌和拮抗菌J-1的数量,发现草鱼饲喂拮抗菌J-1后能够抑制其肠道中嗜水气单胞菌的生长。进一步检测拮抗菌J-1对草鱼相关免疫基因表达量的影响,以验证拮抗菌J-1是否会引起草鱼的炎症反应,结果显示草鱼饲喂含拮抗菌J-1的饵料后能够显著下调肝脏和肾脏中促炎因子IL-1β和TNF-α基因的表达(P<0.05),而显著上调肾脏中抗炎因子TGF-β的表达(P<0.05),未引起草鱼的炎症反应。总体来说该拮抗菌J-1对草鱼免疫基因表达量影响不大,特别是在脾脏中几乎没有影响。4.拮抗菌代谢产物的初步分离:对拮抗菌J-1产生的活性物质进行分离分析,发现其产生的对嗜水气单胞菌有抑制作用的活性成分是由多种物质组成的,分离得到一种化合物经鉴定为1-羟基吩嗪。以上结果表明:从健康草鱼肠道中分离得到的变形假单胞菌(P.plecoglossicida)对嗜水气单胞菌具有较强的拮抗作用,能够在草鱼肠道中定植并且发挥抗病效果,可以进一步开发为草鱼专用抗病微生态制剂。