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肿瘤转移是一个多因素参与、多步骤的复杂过程,其中肿瘤细胞与血管内皮细胞的粘附、肿瘤新生血管生成是肿瘤血道转移的关键步骤。本着中医治疗肿瘤“扶正与祛邪相结合”的基本原则,以“扶正培本、清热解毒”为治疗法则,根据临床实践经验和前人研究的结果,选用具有抗肺癌作用的威麦宁、抗多种肿瘤作用的小檗碱和具有免疫调节作用的黄芪多糖等三种成分组成中药复方,在整体、细胞、分子及基因水平上研究它的抗肺癌细胞增殖及抗肺癌转移作用,并深入探讨其作用的分子机制,为抗肿瘤转移药物的研制和开发及临床抗肿瘤转移治疗提供实验和理论依据。 本研究分三部分: 1)复方威麦宁各组成药体外抗肿瘤作用的研究:为抗肺癌药物——复方威麦宁的药物组方提供实验依据。 2)复方威麦宁抗肺癌体内实验:①复方威麦宁对小鼠 Lewis 肺癌移植瘤的抑制作用:建立小鼠 Lewis 肺癌移植瘤模型,观察用药后小鼠体重和抑瘤率的变化,并检测药物对肿瘤细胞周期的影响;②复方威麦宁抗小鼠 Lewis 肺癌移植瘤自发性肺转移作用及其机制研究:观察复方威麦宁对小鼠 Lewis 肺癌移植瘤自发性肺转移灶形成的影响,并检测药物对瘤细胞粘附分子表达、瘤组织血管生成的影响等。 3)复方威麦宁抗肺癌体外实验:①复方威麦宁对 PG、PAa 肺癌细胞增殖的抑制作用,并深入探讨其对肿瘤细胞周期的影响;②复方威麦宁体外抗肿瘤转移的机制研究:检测复方威麦宁对高转移肺癌细胞(PG)与血管内皮细胞的粘附作用,观察其对 PG 细胞与 HUVEC 表面粘附分子表达的影响及其对肿瘤新生血管生成作用的影响等。 整体动物实验分为六组:生理盐水组(NS)、小檗碱组(Ber)、威麦宁低剂量组(WML)、威麦宁高剂量组(WMH)、复方威麦宁组(FWN)和环磷酰胺组(CTX)。 体外培养 PG 细胞分为五组:空白对照组(Control)、小檗碱组(Ber)、威麦宁组(WMN)、复方威麦宁低剂量组(FWL)和复方威麦宁高剂量组(FWH)。 体外培养 HUVEC 细胞分为六组:空白对照组(Control)、TNF-α对照组(TNF-α)或 bFGF 对照组(bFGF)、小檗碱组(Ber)、威麦宁组(WMN)、复方威麦宁低剂量组(FWL)和复方威麦宁中剂量组(FWM)。实验结果如下:1 复方威麦宁各组成药体外抗肿瘤作用 采用 MTT 法检测复方威麦宁各组成药对所选用的 PG、PAa、A529、BEL-7402、MGC-803 和 B16 等六种肿瘤细胞体外增殖作用,结果显示:小檗碱(20、40μg/ml)、<WP=5>2 复方威麦宁抗肺癌作用及其机制研究威麦宁(125、250μg/ml)对所选用的六种肿瘤细胞具有不同程度的抑制作用,与对照组相比差异显著(P<0.01),而黄芪多糖(10、20μg/ml)的抑制作用不明显。2 复方威麦宁抗肺癌体内实验 2.1 复方威麦宁对小鼠 Lewis 肺癌移植瘤的抑制作用及其机制研究 建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型,灌胃给药观察复方威麦宁对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长的影响。结果显示:口服威麦宁 120-200 mg/kg d对小鼠Lewis肺癌的抑制率为 33.59%-40.63%,口服小檗碱 20g/kg抑瘤率为 15.09%,而口服复方威麦宁的抑瘤率提高到 47.66%,说明此三种药合用有协同抑瘤作用。流式细胞仪检测,复方威麦宁可使瘤细胞阻滞在G0-G1期,与生理盐水对照组相比差异显著(P<0.01)。免疫组化法和Western blotting 技术检测,复方威麦宁可显著降低瘤细胞Cyclin D1的表达(P<0.01)。结果提示:复方威麦宁可能通过降低细胞周期蛋白Cyclin D1的表达,使小鼠Lewis肺癌细胞阻滞在G0-G1期,发挥抗肿瘤作用。2.2 复方威麦宁抗小鼠 Lewis 肺癌移植瘤自发性肺转移作用及其机制研究2.2.1 复方威麦宁对自发性肺转移灶形成的影响 复方威麦宁组小鼠肺转移灶小而少,肺转移发生率为 60%,与对照组相比差异显著(P<0.01),说明复方威麦宁对荷 Lewis 肺癌小鼠肺转移有明显抑制作用。2.2.2 复方威麦宁抗小鼠 Lewis 肺癌移植瘤自发性肺转移作用机制2.2.2.1 复方威麦宁对瘤组织粘附分子表达的影响 免疫组化、RT-PCR、荧光定量 PCR 等方法检测复方威麦宁对瘤组织粘附分子表达的影响,结果表明:复方威麦宁能明显提高瘤组织细胞 E-cadherin 蛋白阳性表达率(55.6%),与 NS 组(33.3%)相比 P<0.01;显著提高瘤组织细胞 E-cadherin mRNA的表达量(P<0.01);同时复方威麦宁能明显降低瘤组织细胞 CD44 蛋白表达水平(P<0.01);降低瘤组织细胞 CD44 mRNA 和 CD44V6 mRNA 表达水平(P<0.01,P<0.05)。结果提示:复方威麦宁抗自发性肺转移作用可能与其增加瘤组织细胞 E-cadherin 的表达和抑制 CD44、CD44V6 的表达有关。2.2.2.2 复方威麦宁对瘤组织血管生成的影响 瘤组织经 HE 染色后镜下观察,可见 NS 组肿瘤细胞呈片状或巢状分布且生长旺盛,癌巢间微血管丰富,复方威麦宁组瘤组织及其周围微血管减少。应用抗 CD34 抗体对瘤组织进行免疫组化法检测,复方威麦宁能显著抑制瘤组织微血管的形成(P<0.01),与瘤组织 HE 染色形态学观察结果相一致。结果提示:复方威麦宁抗自发性肺转移作用可能与其抑制瘤组织血管生成有关。3 复方威麦宁抗肺癌体外实验3.1 复方威麦宁对 PG、PAa 肺癌细胞增殖的抑制作用 MTT法检测结果证明复方威?