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恶性肿瘤已成为严重影响人们生活质量的主要公共健康问题之一,由于肿瘤发生发展的复杂性,药物联合治疗是当前肿瘤治疗中的主要手段。占据主导性地位的化疗药物与其他药物联合的药物治疗是近年来肿瘤治疗的研究热点。目前,常见的药物联合治疗方式包括不同种化疗药物联用、化疗药物和细胞因子联用、化疗药物和单抗联用、化疗药物和基因联用等。其中,细胞因子不仅能够在细胞的生长、增殖和分化中起重要作用,还可以直接诱导肿瘤细胞凋亡或通过调节免疫反应间接诱导肿瘤细胞凋亡,实现抗肿瘤作用。因此,将细胞因子与化疗药物联合应用,二者可通过不同的作用机制抑制肿瘤生长,同时可降低细胞因子和化疗药物的给药剂量,降低毒副作用,细胞因子与化疗药物的联合治疗是一种较为有前景的治疗手段。细胞因子多数是由机体免疫细胞(如单核巨噬细胞、自然杀伤细胞、淋巴细胞等)和某些非免疫细胞(如血管内皮细胞、表皮细胞等)产生分泌的蛋白质,生物活性高,特异性好,应用较为广泛。然而,除了已取得重大进展的细胞因子IL-2和IFN-α,多数细胞因子在肿瘤治疗中的信号通路错综复杂,在肿瘤发展的不同阶段,同种细胞因子可以表现出抑制肿瘤和促进肿瘤的双重作用。颗粒酶B(Granzyme,GrB)是一类主要由自然杀伤细胞和细胞毒T淋巴细胞产生并分泌的丝氨酸蛋白酶,是免疫系统中最后环节中直接用于杀伤肿瘤的“武器”。因其疗效明确,GrB有潜力成为新的用于肿瘤治疗的细胞因子。然而,GrB表面带有较强的正电荷,可与表面荷负电的细胞膜非特异性结合,杀死肿瘤细胞的同时也可将正常细胞杀死。相比全身给药,局部给药可实现精准给药,增加肿瘤部位的药物浓度,并显著降低全身毒性,是实体瘤治疗中一种重要的治疗方式。本课题拟采用局部给药的方式递送GrB,以期降低其全身毒性,并与广谱化疗药物多西他赛(Docetaxel,DTX)进行联合,实现高效抗肿瘤。温敏水凝胶是一种最为常见的用于局部给药的递送载体,在药物的递送中具有以下优势:(1)可实现局部给药,从而形成药物储库,并具有较低的系统毒性;(2)给药方便且可装载多种药物;(3)可显著减缓药物的释放。基于水凝胶的复合载体如胶束-水凝胶、纳米凝胶-水凝胶等,不仅可以综合不同载体的优势,又可弥补各自的不足,是一种具有良好应用前景的递送策略。本课题拟采用纳米载体—胶束共装载GrB和DTX,并将胶束嵌入温敏水凝胶中,局部注射用于肿瘤治疗。基于上述理念,课题设计如下:(1)共递送细胞因子GrB和化疗药物DTX,其中GrB主要通过Caspase依赖途径促进肿瘤细胞凋亡,而DTX通过促进微管蛋白聚集并抑制其解聚而实现抑制肿瘤细胞的有丝分裂,二者通过不同的作用机制实现协同抗肿瘤;(2)采用胶束嵌合水凝胶作为两种不同性质药物的共递送载体,该载体具备pH敏感和温敏特性;(3)采用局部给药的方式进行肿瘤治疗,降低全身毒性。本课题主要研究内容及研究结果如下:1.含量测定方法的建立采用高效液相色谱法建立DTX的含量测定方法学,采用紫外-可见分光光度法建立模型蛋白细胞色素C(Cytochrome C,CC)含量测定方法。测定结果表明,以上含量测定方法专属性和线性良好、精确度和回收率符合测定要求,能分别准确测定共递送载体中DTX及CC的含量。2.共递送载体的制备及表征采用薄膜水化法制备装载DTX的胶束(DTX-PIC micelles,DM),采用静电吸附法制备共载DTX和CC的胶束(CC/DTX-PIC micelles,CDM),并在冰浴条件下搅拌制备共载胶束嵌入水凝胶(CC/DTX-PIC micelles incorporated hydrogel,CDMH)。通过透射电镜、扫描电镜、粒径电位分析仪、流变仪等仪器对其理化性质(粒径、电位、形态、稳定性等)进行了系统性表征。结果表明:共递送载体成功构建,胶束的粒径为26.9±0.09nm,电位为-14.53±0.58mV,DTX和CC的包封率分别为70.84±1.53%和96.04±0.45%。胶束嵌入水凝胶后,35℃开始胶凝,形成凝胶后两种药物仍能共载于胶束中。体外释放结果表明两种药物在pH 5.5条件下可实现快速完全的释放,而在pH 7.4和pH 6.5条件下,胶束嵌入水凝胶中药物的释放速率较慢,从而实现在肿瘤组织内缓慢释放,而被肿瘤细胞摄取后在溶酶体中实现pH响应型快速释放。3.共递送载体的体内外评价采用黑色素瘤为模型,在细胞水平(B16细胞)和动物水平(荷黑色素瘤的C57BL/6小鼠)进行体内外评价。考察共递送载体的深层渗透能力、溶酶体逃逸能力、共递送效率、体内外药效及安全性。结果表明,共递送载体可实现在肿瘤组织内的深层渗透和肿瘤细胞内的溶酶体逃逸,具有较高的体内外共递送效率和良好的体内外协同抗肿瘤效果。初步体内安全性考察结果显示,局部给药后小鼠主要脏器无明显损伤,安全性良好。综上,本课题基于细胞因子与化疗药物联合治疗的理念,构建pH-温度双响应型胶束嵌合水凝胶共递送系统,共递送颗粒酶B和多西他赛,并通过不同抗肿瘤机制协同抑制肿瘤细胞生长,增强肿瘤治疗效果。