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番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)感染可引起患病番鸭出现软脚、腹泻和发育不良等主要症状,病理特征主要为肝、脾肿大且表面出现多量针尖状小白点,因此又称“肝白点病”或“花肝病”,给养禽业造成重大的经济损失。据相关报道,鸡源禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)诱导的凋亡、自噬及细胞融合均与Rho家族蛋白有关。鉴于MDRV与ARV在致病性和基因水平上均存在差异,尽管已有报道称MDRV感染亦能诱导细胞凋亡、自噬以及细胞融合,但其所涉及的分子机制目前尚不清楚,有待进一步研究。为此,本研究对MDRV感染Vero细胞内RhoA/ROCK1/MLC信号通路的影响进行了探索。主要研究内容及结果如下:1.MDRV对Vero细胞RhoA/ROCK1/MLC信号通路的影响。本研究以Vero细胞为模型,运用Western Blot方法检测MDRV感染的Vero 细胞内 GTP-RhoA、RhoA、p-ROCK1、ROCK 1、p-MLC、MLC蛋白表达水平的变化情况。实验结果显示:与空白对照组相比,MDRV感染Vero细胞内的GTP-RhoA、p-ROCK1和p-MLC的表达量均明显增多,且差异极显著(P<0.01)。上述结果初步表明了 MDRV感染能够激活Vero细胞内RhoA/ROCK1/MLC信号通路。为了进一步研究MDRV对RhoA/ROCK1/MLC信号通路的影响,我们采用了ROCK特异性抑制剂Y-27632预先处理Vero细胞,随后进行病毒感染,Western Blot方法检测Y-27632对MDRV感染的Vero细胞内GTP-RhoA、RhoA、p-ROCK1、ROCK1、p-MLC、MLC 蛋白表达水平变化的影响。结果显示:采用抑制剂Y-27632(10μM)预先处理Vero细胞后,MDRV感染细胞内的p-ROCK1、p-MLC蛋白表达水平增高的趋势被抑制且具有显著性差异(P<0.05),而Y-27632对MDRV感染细胞内GTP-RhoA的过表达并无影响,说明RhoA和MLC蛋白分别位于ROCK1信号分子的上游和下游位置。上述结果进一步证实了 MDRV感染能够激活Vero细胞内RhoA/ROCK1/MLC信号转导通路。2.MDRV S组基因编码蛋白对Vero细胞内RhoA/ROCK1/MLC信号通路的影响。为了初步筛选影响细胞RhoA/ROCK1/MLC信号通路的病毒蛋白因子,本研究选取本实验室已经构建好的含有MDRV S组蛋白(σA、σNS、σC、p10.8)编码基因的真核表达质粒分别单独转染至Vero细胞中,应用Western Blot方法检测各组Vero细胞内GTP-RhoA、RhoA、p-ROCK1、ROCK1、p-MLC、MLC 蛋白表达水平的变化情况。实验结果显示:4种转染蛋白均在Vero细胞中得到表达,其中σC、p10.8转染细胞后,可以引起细胞内的GTP-RhoA、p-ROCK1、p-MLC蛋白表达水平较阴性对照组有明显增多,且具有显著性差异(P<0.05),σA蛋白能激活RhoA的活性表达,且具有显著性差异(P<0.05),却并不能引起下游因子ROCK1和MLC的有效激活,σNS转染细胞后GTP-RhoA、p-ROCK1、p-MLC蛋白表达水平并无明显变化。结果表明MDRV σC、p10.8能够激活Vero细胞内RhoA/ROCK1/MLC信号通路,σNS蛋白则不能,而σA虽能活化RhoA,但对ROCK1及MLC无直接激活作用。